Derivatizace v HPLC
2.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny
2.1.6 Schiffovy báze a obdobná činidla
o-Phthaldialdehyd (OPA)/alkylthiol
Reakce
o-phthaldialdehydu za přítomnosti 2-merkaptoethanolu nebo jinými thioly
s primárními aminy a aminokyselinami. Reakce je poměrně rychlá a probíhá za laboratorní
teploty při pH 10. Ukázalo se však, že stabilita 1-alkylthio-2-alkylisoindolového
produktu není vždy dostatečná, neboť dochází často ke spontánním přesmykům.[1] Proto se reakce
uplatňuje častěji při derivatizaci za kolonou,[2],[3],[4] ale našla uplatnění i přípravě derivátů
před chromatografickou separací.[5],[6],[7] Výhodou o-phthaldialdehydu je, že sám
nefluoreskuje, ale samotné deriváty s aminokyselinami mají vynikající fluorescenční výtěžky; excitační maxima derivátů se pohybují okolo 340 nm, emisní maxima se pohybují okolo 450 nm. Schuster doporučuje používat excitační vlnovou délku 230 nm, která snižuje mez stanovitelnosti a je daleko citlivější.[8] Deriváty aminokyselin vykazují konstantní výtěžek fluorescence v rozmezí pH 6,0 až 11,5 a toto je také důvodem upřednostňování postkolonové derivatizace.
Nevýhodou o-phthaldialdehydu je, že reaguje pouze s primárními aminokyselinami a sekundární aminokyseliny jako prolin a hydroxyprolin tuto reakci neposkytují. Tento problém se obchází tak, že oxidací prolinu resp. hydroxyprolinu chlornanem sodným vzniká meziprodukt, který reaguje s o-phthaldialdehydem. Této reakce se pak využívá i při dvoustupňové postkolonové derivatizaci aminokyselin o-phthaldialdehydem. Sekundární aminokyseliny jsou podrobeny v prvém stupni reakci s chlornanem za zvýšené teploty a následně ve druhém stupni jsou derivatizovány o-phthaldialdehydem.[9],[10] Jako thioly se nejčastěji používá 2-merkaptoethanol, ale současně se i používá 3-merkapto-1-propanol[11] ethanthiol[12] a 3-merkaptopropionová kyselina. [13]Sirné aminokyseliny cystein a cystin poskytují s o-phthaldialdehydem isoindolové deriváty, ale jejich fluorescenční výtěžek je velmi nízký, nedochází ke kompletní konverzi nebo vzniklý produkt není dostatečně specifický. Proto se musí před vlastní derivatizací cyst(e)in oxidovat kyselinou permravenčí [14],[15] na kyselinu cysteovou, která ochotně reaguje s o-phthaldialdehydem a
poskytuje isoindolové deriváty, jejichž fluorescenční výtěžek je srovnatelný s ostatními aminokyselinami, nebo se blokuje thiolová skupina v molekule cyst(e)inu. Z důvodu ztrát a špatné reprodukovatelnosti při oxidaci těchto sirných aminokyselin se u cysteinu a jeho dimeru cystinu nejčastěji uplatňují alternativní metody blokace thiolové skupiny. Jedním z možných kroků je reakce cyst(e)inu s 3,3´-dithiopropionovou kyselinou na stabilní meziprodukt S-2-Carboxyethylthio-L-cystein, který již ochotně reaguje s o-phthaldialdehydem.[16] Následně reaguje o-phthaldialdehyd s S-2-Carboxyethylthio-L-cysteinem (Cys-MPA) na stabilní isoindolový produkt. Byla publikována jednouchá metoda.[17] Je založena na reakci kyseliny jodoctové s cysteinem za vzniku derivátu cysteinu, ve kterém je blokována
thiolová skupina.
Benzoin
Benzoin (2-hydroxy-2-fenylacetofenon) kondenzuje se substituovaným guanidinem na 2-substituovaný amino-4,5-difenylimidazol.[18] Tyto imidazoly jsou vhodné k chromatografické separaci s fluorescenční detekcí s excitační vlnovou délkou 325 nm a
emisní vlnovou délkou 425 nm. Reakce probíhá v methylcellosolvu za přítomnosti 2-merkaptoethanolu, siřičitanu sodného a hydroxidu draselného za varu. Reakce je ukončena přídavkem kyseliny chlorovodíkové a následně pufru 0,5 M-Tris/HCl na pH 9,2. Přídavek 2-merkaptoethanolu stabilizuje výsledný derivát imidazolu a siřičitan sodný potlačuje pozadí fluorescence. Derivatizace byla uplatněna při stanovení guanidinových derivátů - creatinu, agmatinu apod.[19],[20]
Literatura
[1] Simons S.S., Johnson D.F.: J. Amer. Chem. Soc. 98, 7098 1976).
[2] Roth M., Hampai A.: J.Chromatogr. 83, 353-356 (1973).
[3] Fujita K., Nagatsu T., Maruta K., Teradaira
R., Beppu H., Tsujt Y., Kato T.: Anal. Biochem. 82, 130 (1977).
[4] Engbaek F., Magnussen I.: Clin. Chem. 24, 376 (1978).
[5] Roth M.: Anal. Chem. 43, 880 (1971).
[6] Hughes G.J., Wilson J.K.: J. Chromatogr. 242, 337 (1982).
[7] Godel H., Graser T., Földi P., Pfaender P., Fürst P.: J. Chromatogr. 297, 49 (1984).
[8] Schuster R.: J. Chromatogr. 431, 271 (1988).
[9] P.A. St. John, Aminco Laboratory News, 31, No.1 (1975).
[10] Ishida Y., Fujita T., Assai K.: J. Chromatogr. 204, 143 (1981).
[11] Stobbauch J.F., Repta A.J., Sternson L.A., Garren K.W.: Anal. Biochem. 135, 495 (1983).
[12] Simons S.S., Johnson D.F.: Anal. Biochem. 82, 250 (1977).
[13] Kucera P., Umagat H.: J. Chromatogr. 255, 563 (1983).
[14] Hirs C.H.W.: Methods Enzymol 11, 197 (1967).
[15] Gurd F.R.N.: Methods Enzymol 25, 424 (1972).
[16] Barkholt V., Jensen A.L.: Anal. Biochem. 177, 318 (1989).
[17] Cooper J.D., Turnell D.C.: J. Chromatogr. 227, 158 (1982).
[18] Kai K., Yamaguchi M., Ohkura Y.: Anal. Chim. Acta 120, 411 (1980).
[19] Kai K., Miyazaki T., Yamaguchi M., Ohkura Y.: J. Chromatogr. 268, 417 (1983).
[20] Kai K., Miyazaki T., Ohkura Y.: J. Chromatogr. 311, 257 (1984).
Last modified: