Derivatizace v HPLC

1.3 Činidla pro hydroxyderiváty

Mezi hydroxyderiváty patří alkoholy, fenoly cukry a steroidy a mnohé z nich jsou důležité biologické sloučeniny. Hydroxylová skupina ochotně přechází na estery reakcí s acylchloridy nebo mohou být derivatizovány substituovanými isokyanáty na N,N´- alkyl disubstituovanou močovinu.

1.3.1 Acylchloridy

Acylchloridy patří mezi nejznámější a nejrozšířenější derivatizační činidla hydroxylové skupiny; esterifikační reakce s benzoylchloridem a jeho analogy zavádí do molekuly vysoce absorptivní chromofor. Mezi tyto činidla patří benzoylchlorid, p-chlorbenzoylchlorid, p-methoxybenzoylchlorid, p-nitrobenzoylchlorid a 3,5 - dinitrobenzoylchlorid. Acylchloridy reagují rovněž s primárními a sekundárními aminy.

Benzoylchlorid

Benzoylchlorid je vhodný k derivatizaci cukrů, alkoholů a glykolů.[1] Reakce probíhá v alkalickém prostředí k odčerpání vznikajícího chlorovodíku z reakčního prostředí, nejvíce se používá pyridin, triethylamin. Pracuje se za zvýšené teploty 60 až 80 °C. UV detekce je při 230 nm, detekční limit je 2 ng až 20 ng.

p-Methoxybenzoylchlorid

Derivatizace probíhá v prostředí hydroxidu sodného při teplotě 40 °C do 60 minut. Detekční limit se pohybuje řádově v 10 ng.[2] Separace probíhá na normální fázi Silica s mobilní fází a-heptan/chloroform (3:2, v/v).

p-Nitrobenzoylchlorid

p-Nitrobenzoylchlorid byl použit k derivatizaci mono-, di- a trisacharidů v pyridinu. Vlastní derivatizace vyžaduje 75 minut a deriváty vykazují maximum absorbance při 260 nm. Relativně nepolární deriváty dovolují rychlou separaci na polární fázi (silikagel nebo oxid hlinitý).[3]

3,5-Dinitrobenzoylchlorid

3,5-dinitrobenzoylchlorid byl použit k derivatizaci glykosidů (digitoxin, digoxin aj.) za laboratorní teploty v pyridinu do 2 hodin. Separace byl provedena na reverzní fázi C18 za použití mobilní fáze acetonitril/methanol/voda (3:1:1, v/v). Deriváty vykazují absorbční maximum při 230 nm a odezva je lineární od 1,3 do 35 pmol. Detekční limit je řádově v jednotkách ng.

V poslední době byla pospána syntéza anthracen-9-karbonylchloridu a jeho aplikace jako derivatizačního činidla pro aplikace v UV a fluorescenční detekci hydroxysloučenin. Reakce probíhá v acetonitrilu a reakční rychlost závisí na struktuře alkoholu od 10 minut do 10 hodin. Deriváty vykazují absorbční maximum při 250 nm.

1.3.2 Fenylisokyanáty (PIC)

Fenylisokyanáty reagují s hydroxyskupinou podobně jako aminy. Adicí alkoholů na isokyanáty vznikají estery N-substituovaných karbamových kyselin. Reakce probíhají v dimethylformamidu za laboratorní teploty do 15 minut bez použití katalyzátorů. Přebytek derivatizačního činidla se rozloží přídavkem methanolu. Deriváty jsou separovány na reverzní fázi při teplotě 50 °C s UV detekcí při 230 nm.[4] Byla vyvinuta metoda pro stanovení sorbitolu a galactitolu derivatizací fenylisokyanatanem v pyridinu při teplotě 55 °C. Nadbytek činidla je rozrušen přídavkem methanolu. Separace probíhá na reverzní fázi při 240 nm, detekční limit je 3 ng.[5]

Literarura

[1] Lehrfeld J.: J. Chromatogr. 120, 141 (1976).
[2] Porcaro P.J., Shubiak P.: Anal.Chem. 44, 1865 (1972).
[3] Nachtman F., Budna K.W.: J. Chromatogr. 136, 278 (1977).
[4] Bjorkqvist B., Tovivonen H.: J. Chromatogr. 153, 265 (1978).
[5] Dethy J.-M., Callaert-Deveen B., Janssens M., Lenaers A.: Anal. Biochem. 143, 119 (1984).
 

Last modified: