Derivatizace v HPLC

 

2.2 Činidla pro karbonylovou skupinu

 

2.2.1 Substituované hydraziny

2.2.2 Činidla pro alfa-ketokyseliny

2.2.3 Kondenzace alifatických aldehydů s 1,3-diketony a amoniaku na deriváty lutidinu

Literatura

 

2.2.1 Substituované hydraziny

 

Dansylhydrazin (Dns-H)

Aldehydy a ketony reagují se substituovanými hydraziny za vzniku hydrazonů a jsou analogické 2,4-dinitrofenylhydrazinu. Dansylhydrazin se připravuje reakcí koncentrovaného dansylchloridu s velkým nadbytkem monohydrátu hydrazinu v acetonu. Po ukončení reakce se reakční směs zředí vodou a produkt se extrahuje ethylacetátem. Dansylhydrazin je rozpustný v organických rozpouštědlech, teplota tání 126 ^oC. Reakce Dns-H s karbonylovou skupinou probíhá v ethanolické HCl za teploty varu asi 10 minut. Reakce je ukončena po ochlazení na laboratorní teplotu přídavkem pyruvátu a deriváty jsou extrahovány do diethyletheru.[1] Bylo popsáno rovněž použití kyseliny trichloroctové v benzenu jako reakčního prostředí místo ethanolické HCl.[2]

Otevření cyklického hemiketalu v kyselém prostředí na otevřený hydroxyaldehyd, který obsahuje volnou karbonylovou skupinu a která může dále vstupovat do dalších reakcí. Reakce byla využita při stanovení maduramicinu v krmivech (fluoreskující derivát s excitačním maximem při 220 nm a emisním maximem 470 nm).[3] Reakce karbonylové skupiny byla využita rovněž ke stanovení monosacharidů i polysacharidů.[4] Detekční limit byl stanoven na 0,5 nmol.  Fluoreskující deriváty mají excitační maxima závislá na složení derivátu - 240 nm a 360-370 nm a emisní maxima 525 - 540 nm.

 

2-Difenylacetyl-1,3-indendion-1-hydrazin

2-Difenylacetyl-1,3-indendion-1-hydrazin reaguje rovněž s ketony a aldehydy za vzniku derivátů s excitačním maximem v rozmezí od 400 do 415 nm a emisním maximem kolem 525 nm.[5]^,[6]

 

4-Hydrazo-7-nitrobenzofurazan (Nbd-H)

Činidlo se připravuje obdobně jako Dns-H reakcí Nbd-Cl (4-chloro-7-nitrobenzofurazan) a nadbytkem hydrazinu a poskytuje deriváty obdobných vlastností. Výtěžek derivatizační reakce je asi 99 %.[7]

 

2.2.2 Činidla pro a-ketokyseliny

 

o-Fenylendiamin

Kondenzací o-fenylendiaminu a a-ketokyseliny vzniká vysoce fluoreskující derivát hydroxychinolinu.[8] Reakce probíhá ve vodném prostředí kyseliny chlorovodíkové za přítomnosti merkaptoethanolu. Směs se zahřívá 30 minut na bodu varu a po ochlazení se přidá bezvodý síran sodný. Deriváty hydroxychinolinu jsou extrahovány z reakčního prostředí ethylacetátem. Přídavek merkaptoethanolu je nutný k odstranění přítomného kyslíku v reakční směsi. Substituované deriváty hydroxychinolinu jsou poměrně stabilní, excitační maxima většiny a-ketokyselin se pohybují kolem 375-377 nm, emisní maxima kolem 407 nm.[9] Detekční limit se pohybuje řádově v pmolech, separace na chromatografické koloně probíhá jak v isokratickém tak gradientovém módu. [10] ^, [11]

 

1,2-Difenylethylendiamin (DPE)

1,2-Difenylethylendiamin je analogem o-fenyldiaminu a používá se k derivatizaci a-ketokyselin (catecholaminů,[12] kyseliny glyoxalové,[13] dopaminu v séru a moči[14]). Deriváty cyklického difenylimidazolidinu mají excitační maxima 345 nm a emisní maxima kolem 485 nm.

 

1,2-Diamino-4,5-methylendioxybenzen (DMB)

1,2-Diamino-4,5-methylendioxybenzen byl popsán jako kondenzační činidlo pro stanovení a-ketokyselin v séru a moči.[15] Hlavní výhodou DMB je velmi nízká mez detekce a pohybuje se od 6 do 30 fmol v 5 ml vzorku.

 

2.2.3 Kondenzace alifatických aldehydů s 1,3-diketony a amoniaku na deriváty lutidinu

Aldehydy kondenzují s 1,3-diketony (1,3-cyklohexandion) za přítomnosti amoniaku na fluoreskující deriváty lutidinu. [16] ^, [17] Optimální pH reakce je okolo 5 (jako pufr se využívá octan amonný pH 4,5). Reakce probíhá při 95 °C po dobu 20 minut. Excitační maximum derivátů je okolo 385 - 400 nm a emisní maximum 450 - 460 nm. Detekční limit se pohybuje řádově kolem fmol.

   

Literatura