Silně polární a iontové látky na nepolárních fázích se zadržují velmi málo nebo vůbec ne a eluují v mrtvém objemu kolony nebo dříve, než odpovídá mrtvému objemu kolony - což je jev tzv. iontové výluky. Pro látky iontové povahy proto můžeme jejich chromatografické chování ovlivnit volbou pH mobilní fáze, kdy změnou pH mobilní fáze dochází k potlačení disociace slabých kyselin (pH < 7) či slabých bází (pH > 7). Potlačením disociace (obrázek) dochází ke zvýšení retence a zamezení chvostování píku dané chromatografované látky. Pro organické kyseliny dochází k potlačení disociace snížením pH na hodnotu asi pH 2-5, pro organické báze dochází k potlačení disociace zvýšením pH na hodnotu asi pH 7-8, ale toto pH je omezeno rozpouštěním silikagelu při pH > 8,5. Selektivita pro karboxylové kyseliny na reverzní fázi je závislá na použité mobilní fázi (její pH) a na použité reverzní fázi. V reverzních stacionárních fázích závisí retence jednosytné kyseliny HA na pH a na disociační konstantě karboxylové kyseliny K_a:

kde

k₀ a k_-1jsou retenční faktory neionizované a ionizované formy a a je stupeň disociace (frakce ionizovaných molekul). Obdobně pro selektivitu bazí na reverzní fázi platí stejná rovnice kde

Zvýšení retence a zlepšení symetrie píků ionizovaných látek se může dosáhnout přídavkem neutrálních solí do mobilní fáze - tzv. vysolovací efekt.^[1]

Závislost stupně disociace na pH (kyselina sorbová (___) pK_a = 4,76 a benzoová (---) pK_a = 4,19)

V případě, že se získá lineární závislost kapacitního poměru k na stupni disociace a (v lineární oblasti závislosti stupně disociace a na pH solutu) pak pro k₀ a k_-1 platí:

Určením koeficientů k₀ a k_-1 je možné predikovat chování solutů při změně pH mobilní fáze. Jestliže platí k_-1 ≠ k_-1 pak změnou pH můžeme ovlivnit sepraci solutů (selektivitu systému). Experimentální hodnoty kapacitních poměrů kyseliny benzoové a sorbové při separaci na reverzní fázi C18 získané při různém pH mobilní fáze (pH 3,5 - 4,5) jsou zpracovány graficky:

Ze získaných experimentálních dat byly vypočteny kapacitní faktory k₀ a k_-1 pro kyselinu benzovou (k₀ = 6,10; k_-1 = 1,23) i sorbovou (k₀ = 5,81; k_-1 = 0,73). Při pH 4,5 je selektivita systému nejvyšší a kapacitní poměr získaný experimentálně pro kyselinu benzoovou je 2,84 (výpočtem pak 2,83), kapacitní poměr získaný experimentálně pro kyselinu benzoovou je 4,04 (výpočtem pak 4,01). Experimentální a vypočtená data jsou tak ve výborné shodě.

Pro eluční poměr (selektivitu) r_2,1 můžeme odvodit rovnici:

kde index ´´ značí kyselinu sorbovou a index ´ se vztahuje ke kyselině benzoové. Na základě této rovnice byl vypočten eluční poměr r_{2,1 (teor)} = 1,42 což odpovídá experimentálně získanému elučnímu poměru r_{2,1 (exp)} = 1,42.

Jako příklad vlivu pH na separaci kyseliny salicylové (SA; pK_a=2,98) a acetysalicylové (ASA; pK_a=3,50) je ukázán na následujících obrázcích.

Separace kyseliny salicylové a acetylsalicylové; pH 6.2

Separace kyseliny salicylové a acetylsalicylové; pH 3.8

Separace kyseliny salicylové a acetylsalicylové; pH 1.8

Související odkazy

Potlačení disociace polárních látek

Jednoduchý kalkulátor pro výpočet % ionizace kyselin a bazí...

Literatura

[1]. Jandera P., Churáček J., Bartošová J.: Chromatographia 13, 485 (1980).

[Top of Page]

Last modified: 22. ledna 109