Monolitické kolony

Na rozdíl od konvenčních stacionárních fází, které se skládají z jednotlivých částic sorbentu o definované velikosti, monolitické HPLC kolony tvoří jediný kus pórovitého materiálu, který zcela zaplňuje vnitřek separační kolony. Klasické 3-5 µm částicové kolony vykazují výbornou separační účinnost, ale se snižující se velikostí sorbentu stoupá zpětný tlak, takže maximální rychlost průtoku je omezená. Největší výhodou monolitických kolon ve srovnání s klasickými částicemi plněnými kolonami jsou jejich hydrodynamické vlastnosti. [1] Monolitické kolony mají dva typy pórů: a) velké póry (makropóry) zajišťují rychlý konvektivní tok mobilní fáze skrz monolit a významně zrychlují přenos hmoty mezi mobilní a stacionární fází, b) středně velké póry (mesopóry) poskytují monolitu dostatečně veliký povrch, a tím vysokou separační kapacitu. [2] Tato struktura umožňuje provozování monolitů při značně vysokých rychlostech mobilních fází bez přílišného zvýšení tlaku a zároveň bez ztráty separační účinnosti, a to i pro separované makromolekuly (bílkoviny, syntetické polymery).

Podle chemické podstaty a způsobu přípravy se mohou monolitické stacionární fáze rozdělit:

  • Anorganické monolity
  • Makroporézní polymerní monolity
  • Stlačitelné monolity (komprimované gely)

    • Anorganické monolity

    První monolitické stacionární fáze na bázi silikagelu připravili a popsali profesoři Nakanashi, Soga a Tanaka. [3] V současné době jsou komerčně dostupné pod značkou Chromolith od firmy Merck nebo v licenci Merck od firmy Phenomenex, kolony Onyx™.

    Připravují se hydrolytickou polymerací tetramethoxysilanu nebo tetraethoxysilanu ve vodném roztoku kyseliny octové v přítomnosti polyethylenglykolu. Technologie výroby umožňuje přípravu monolitů s přesně definovanou strukturou, kdy vznikají výhradně mesopóry a makropóry vhodných a nastavitelných rozměrů.

    Obrázek č. 1 Mesopóry a makropóry monolitu

    Nevýhodou je objemová kontrakce, ke které při zrání monolitu dochází, což následně vyžaduje zatěsnění monolitu do pláště/kolony před jeho aplikací v HPLC. Připravené monolitické silikagelové kolony mohou být snadno modifikovány například zavedením oktadecylových funkčních skupin na jejich povrch pro použití v chromatografii s reverzními fázemi. Monolitické kolony poskytují srovnatelnou účinnost jako kolony konvenční s velikostí sorbentu 5 µm. Výhodou monolitu je ovšem skutečnost, že se mohou aplikovat podstatně vyšší průtoky mobilní fáze, např. při použití monolitické kolony o vnitřním průměru 4,6 mm a délce 10 cm může rychlost mobilní fáze nabývat až 10 ml/min bez překročení tlakového limitu čerpadla a kolony. Silikagelové monolity se osvědčily na rozdíl od organických monolitů i při separaci malých molekul.

    Makroporézní polymerní monolity

    Tyto monolity jsou připravovány přímo v prázdné koloně, která se naplní polymerační směsí, tedy směsí monomerů, porogenů a iniciátorem, pak se uzavře a za tepla je provedena polymerace. Monolit se následně promyje vhodným solventem pro odstranění nezpolymerizovaných látek a může být rovnou užit pro HPLC separace. K těmto typům organických polymerů se především řadí polymerní gely na bázi hydroxyethyl-methakrylátu, glycidyl-methakrylátu a polystyrenu [4],[5],[6]. Postup přípravy je ukázán na onrázku č. 2

    Obrázek č. 2 Postup přípravy makroporézní polymerních monolitů

    Stlačitelné monolity (komprimované gely)

    Koncem 80.tých let prováděl prof. Hjertén experimenty s částicemi neporézní agarózy a zjistil, že při stlačení sloupce sorbentu hydrostatickým tlakem proudící kapaliny překvapivě došlo ke zvýšení permeability stacionární fáze a současně i ke zlepšení separace. Na základě těchto experimentů připravil monolit polymerací vodného roztoku N,N’-methylenbis-akrylamidu a kyseliny akrylové v přítomnosti anorganické soli (síran amonný), který následně v koloně silně stlačil (až na 10 % původního objemu) a získal velmi dobré separace bílkovin.[7] Tato technologie po určitém vylepšení byla přejata firmou BioRad.

    Reprodukovatelnost monolitických kolon

    Přestože každá připravené monolitická kolona je vlastně prototypem, je jejich příprava většinou poměrně dobře reprodukovatelná. Například, reprodukovatelnost relativních retenčních časů dosahovaná na komerčních monolitech Chromolit vyjádřená jako RSD je do 4%.

    Literatura

    [1] Peters E.C., Petro M., Švec F., Fréchet J.M.J.: Anal.Chem. 69, 3646 (1997).
    [2] Roper D.K. Lightfoot E.T.: J. Chromatogr., A 702, 3 (1995).
    [3] Tanaka H., Kamada M., Nyudo M., Ohira M.: J. Chromatogr. A, 762, 89 (1997); NakanashicK., Soga N.: 1. Am. Ceram. Soc., 74, 2518 (1991); Tanaka N., Ishizuka N., Hosoya K., Kimata K., Minakuchi H., Nakanashi K., Soga N.: Kuromatogurafi 14, 50 (1993); Minakuchi M., Nakanashi K., Soga N., Ishizuka N., Tanaka N.: Anal. Chem. 68, 3498 (1996).
    [4] Fujimoto C.: Anal.Chem. 67, 2050 (1995).
    [5] Palm A., Novotny V.: Anal.Chem. 69, 4499 (1997).
    [6] Petro M., Švec F., Gitsov I., Fréchet J.M.J.: Anal.Chem. 68, 315 (1996).
    [7] Hjertén S., Liao J. L., Zhang R.: J. Chromatogr. 473, 273 (1989).

    Poznámka:

    Obrázky a části texu jsou publikovány se svolením Dr. Davida Sýkory, dále bylo čerpáno z článku: Švec F.: Chem.Listy 98, 232 (2004). Chemicke Listy

     
    [Top of Page]
     
    Last modified: