Chromatografická kolona

Nejčastější rozměry chromatografických kolon, které jsou komerčně dodávány, jsou 50 mm, 75 mm, 100 mm, 125 mm, 150 mm, 250 mm a 300 mm o vnitřním průměru 2 mm až 5 mm. Chromatografické kolony se dodávají v současné době jako klasické kovové kolony nebo kovové kolony typu „cartridge“ a při skladování a transportu jsou plněné mobilní fází (tabulka).

Tabulka: Typy kolon a jejich uchovávání

Při uchovávání kolon, které se nepoužívají déle jak 72 hodin, mělo by se postupovat podle následujících doporučení:

nikdy nenechávat kolonu vyschnout, vždy ji uchovávat naplněnou doporučenou mobilní fází, zásadně ne pufrem

kolonu s reverzní fází je nejlépe uchovávat naplněnou 10 % vodným roztokem isopropanolu, který zabraňuje mikrobakteriálnímu růstu, acetonitrilem nebo methanolem

kolonu uchovávat uzavřenou originálními uzávěrkami a na suchém, ale ne příliš teplém místě

chránit kolonu před vibracemi a nárazy

po každé analýze kolonu propláchnou mobilní fází o vysoké eluční síle (reverzní fáze - methanol, acetonitril, normální fáze – hexan/acetonitril) a poté kolonu naplnit mobilní fází pod kterou se bude kolona uchovávat. Při použití pufrů (na reverzní fázi) neopomenout nejprve propláchnou kolonu vodou nebo mobilní fází methanol/voda (30+70 maximálně 50+50), v opačném případě může dojít k vysrážení pufrů v systému!

Kolona se používá podle typu náplně kolony, obecně lze říci, že u běžných typů kolon na normální a reverzní fázi se rozmezí pH pohybuje od 2 do 8, při iontové chromatografii je rozmezí pH daleko širší a pohybuje se od pH 2 – 12. Při použití fosfátových pufrů pH 8 na normální i reverzní fázi, zejména v kombinaci za vyšší teploty však dochází k výraznému snížení životnosti kolony – dochází k rozpouštění silikagelu:

Obr. 1 Rozpustnost silikagelu ve vodě v závislosti na pH

Pro vysoké teploty je před fosfátovými pufry preferován pufr TRIS a pracovní pH 7. Pracovní tlak na chromatografické koloně by neměl překročit pro kovové a kolony typu „cartridge“ 40 MPa (395 atm, 5800 PSI). Pro výpočet teoretického tlaku na chromatografické koloně se postupuje podle následující rovnice pro tlakový spád na koloně Dp (MPa) pro mobilní fázi vodu při průtoku mobilní fáze 1 ml/min:

kde L je délka kolony v mm, f je faktor – 10,13 pro kovovou kolonu, 20,26 pro kolonu typu „cartridge“, d_p – průměr částic náplně v µm, d_c – průměr kolony v mm, h - dynamická viskozita. Rozdíl mezi vypočteným tlakovým spádem na koloně a skutečností je ještě akceptovatelný při rozdílu 10 až 15 %.

Obecně před každým použitím kolony (nové nebo kolony skladované) se musí kolona ekvilibrovat. Před ekvilibrací kolony je nutné se vždy přesvědčit, zda ekvilibrující mobilní fáze je mísitelná s mobilní fází, kterou je naplněna kolona. Obsahuje-li mobilní fáze soli nebo pufry je nutné před ekvilibrací kolony touto mobilní fází kolonu propláchnout asi 10 kolonovými objemy vody nebo směsí voda - methanol v poměru 1:1 (postačují asi 3 kolonové objemy) a následně směsí pufr - methanol v poměru 1:1 a poté již ekvilibrovat samotnou mobilní fází. Při změně mobilní fáze, při přechodu z jedná mobilní fáze na druhou je nutné postupně zvyšovat průtok nové mobilní fáze od 0 ml/min do 1 ml/min při přírůstku asi 0,1 ml/min. Délka ekvilibrace kolony závisí na používané mobilní fázi a obvykle je objem mobilní fáze kolem 10 kolonových objemů (do stabilizace základní linie). V případě použití chromatografie iontových párů zvyšuje se objem mobilní fáze na 100 až 200 kolonových objemů.

Jednou z možných příčin problémů může být  přechod z reverzního systému na systém normální fáze. Je nutné si uvědomit, že systém normální fáze (kolony Silica, Alumina) jsou extrémně citlivé vůči koncentraci vody v mobilní fází. Zbytková voda přítomna v systému i v minimálních koncentracích může ovlivnit dobu ekvilibrace kolony a mnohonásobně ji prodloužit, může docházet k distorzi píku. Při přechodu z reverzní fáze na normální je vhodné celý systém propláchnout 100 % acetonitrilem nebo methanolem a následně systém (kolonu) ekvilibrovat používanou mobilní fází.

Instalace kolony a spojovací potrubí

Typický chromatografický systém obsahuje rozmanité množství a druhů potrubí a spojek, které slouží k usnadnění spojení mezi:

zásobníkem mobilní fáze a chromatografickou pumpou

chromatografickou pumpou a nástřikovým zařízením

nástřikovým zařízením a kolonou

kolonou a detektorem

detektorem a odpadem

Volba spojovacího potrubí musí minimalizovat mrtvý objem systému, ale současně by neměl nadbytečně omezovat tok mobilní fáze systémem. Typické chyby užití spojovacího potrubí, které se nejčastěji vyskytují:

1. špatné spojení potrubí – kolona
2. hardwarové spojení potrubí – kolona různých firem
3. použití spojovacího potrubí nesprávného vnitřního průměru, které mohou mít za následek:

1. rozšiřování eluční zóny
2. netěsnost v systému
3. velký tlakový spád v systému
4. zvýšení šumu základní linie

V chromatografickém systému se nejčastěji používá potrubí o vnějším průměru 3,2 mm nebo 1,6 mm, ale klasifikace potrubí je podle vnitřního průměru: 0,12 mm (0,005 palců), 0,15 mm (0,006 palců), 0,18 mm (0,007 palců), 0,23 mm (0,009 palců), 0,25 mm (0,010 palců), 0,5 mm (0,020 palců), 0,75 mm (0,030 palců), 1,0 mm (0,040 palců) a 1,17 mm (0,046 palců). Při instalaci spojovacího potrubí je potřeba používat potrubí co nejkratší délky k omezení mrtvého objemu systému na nejnižší míru. Toto pravidlo je nutné uplatňovat zejména při instalaci potrubí za nástřikovým zařízením a pro kolony o vnitřním průměru 3 mm a nižší, kdy se používá spojovací potrubí o průměru 0,12 mm a mezi chromatografickou pumpou a nástřikovým zařízením spojovací potrubí o průměru 0,25 mm. Zásadně nepoužívat potrubí se zářezy nebo potrubí zahnuté do velmi ostrých úhlů (zejména pro potrubí o vnitřním průměru 0,5 mm a vyšším) což může vést k omezení toku mobilní fáze tímto potrubím. Po instalaci veškerého spojovacího potrubí v celém LC systému a po úspěšném ověření účinnosti je vhodné provést zmapování veškerého potrubí (zejména co se týče použití potrubí vhodného vnitřního průměru), což v budoucnosti zamezí záměně potrubí při jeho opravách a výměně. Způsob zapojení spojovacího potrubí je ukázán na obrázku č.2.

Poznámka č. 1:

Pro výpočet objemu kapiláry můžete použít jednoduchý kalkulátor...

Poznámka č. 2:

Převod anglosaských jednotek na metrické a barevné značení kapilár můžete nalézt zde.

Obr.2 Tlaková montáž spojovacího potrubí

1 – kapilára (spojovací potrubí), 2 – tlakový šroub, 3 – ferrulka (těsnící kroužek), 4 – kritická vzdálenost pro každé hardwarové zařízení, 5 – konec spojovacího potrubí

Při instalaci kolony je vhodné se ujistit zda sedlo ferrulky je kompatibilní s nástavcem kolony, protože technicky pro různá zařízení od různých firem tato kompatibilita není zajištěna (viz obrázek č. 3 A).

Obr.3A Ukázka zapojení spojovacího potrubí

Vzdálenost mezi koncem spojovacího potrubí a ferrulkou je kritická vzdálenost pro každé hardwarové zařízení vzhledem ke spojení potrubí – kolona (nástavec kolony). Konec spojovacího potrubí musí být rovný a hladký vzhledem k dosažení nejvyšší možné účinnosti kolony. Na obrázku č. 3 B je ukázka spojení potrubí a kolony – 1 – správné spojení spojovací potrubí – kolona (resp. celou detektoru, dávkovačem), 2 – mrtvý objem vznikající nedokonalým napojením potrubí (příliš krátké spojovací potrubí za ferrulkou), 3 – netěsnost v systému vzniklá nesprávným použitím ferrulky (příliš dlouhé potrubí za ferrulkou).

Obr.3B Ukázka zapojení spojovacího potrubí

V současné době jsou na trhu k dostání šroubení, která při spojení kapilár s dalším hardwarem (kolona, spojka, detektor, autosampler) zajišťují téměř nulový mrtvý objem tak, že k dochází ke spojení kapiláry s hardwarem těsným dosednutím konce kapiláry a hardwaru (tzv. Viper fingertight fitting). Těsnosti tudíž není dosaženo pomocí ferrulky jako u staré kontrukce šroubení, ale koncovkou (těsněním) na spojovací kapiláře (obrázek č. 4). Ferrulka je spojená se šroubem napevno a kritická vzdálenost mezi ferrulkou a koncem kapiláry je natolik dlouhá, že umožňuje těsné spojené s každým typem šroubení.

Obr.4 Zapojení spojovacích kapilár pomocí Viper fingertight fitting. (A) Šroub s ferulí 1 – kritická vzdálenost, 2 – tlakový šroub s ferulí, 3 -těsnění. (B) Zapojení do kolony.

O chromatografické koloně se dozvíte více (zde).

[Top of Page]

Last modified: