Mrtvý objem chromatografické kolony V_M se zjišťuje jako retenční objem inertu o malé molekulové hmotnosti, o níž lze předpokládat, že pronikne do všech pórů náplně (např. benzen pro silikagel a dichlormethan jako mobilní fázi, aceton nebo dusičnan sodný [1] pro reverzní fázi a acetonitril mobilní fázi). Určení V_M činí velké potíže a stanovení může být zatíženo systematickou chybou, která ovlivňuje přesnost určení kapacitních poměrů. Při vyhodnocování V_M z chromatogramů je si třeba uvědomit, že určením V_M se zjistí celkový mrtvý objem systému a nikoli pouze mrtvý objem kolony a pro exaktní výpočty se musí odečíst mrtvý objem systému (spojovací potrubí, objem nástřikovacího zařízení, objem cely detektoru).

Na určení mrtvého objemu existuje několik způsobů, ale hodnověrnost získaných výsledků je neustále diskutabilní.^[2] K určení objemu systému se nejlépe postupuje tak, že se ze systému vyřadí chromatografická kolona a nastříkne se do systému dobře detekovatelná látka (např. aceton, dusičnan sodný) při průtoku mobilní fáze (např. acetonitrilu) 1 ml/min. Sleduje se retenční objem látky, ze kterého se pak určí objem systému. Z vlastní zkušenosti se mi pro určení mimokolonového objemu osvědčil následující postup: ze systému je vyřazena chromatografická kolona a pak je nastříknuto 10 µl 0,1 % roztoku acetonu při průtoku mobilní fáze (acetonitril) 1 ml/min. Experiment se opakuje 3krát a měří se čas od nástřiku po zaznamenání maximálního signálu acetonu v detektoru. Z naměřených výsledků a známého objemového průtoku mobilní fáze se vypočte průměrný mimokolonový objem systému.

Pro určení mrtvého objemu kolony byl použit stejný postup jako je popsáno výše, ale do systému byla zařazena chromatografická kolona a od zjištěné hodnoty mrtvého objemu kolony byl odečten mimokolonový objem systému. Mrtvý objem kolony je možné rovněž vypočítat přibližně z rovnice:

V₀ = d_c²pLe_T/4

kde průměrná porovitost náplně kolony e_T = 0,70. Na výpočet můžete použít kalkulátor nebo se podívat do tabulek...

Mrtvý objem systému HPLC zahrnuje veškerý objem chromatografu od chromatografického čerpadla až po výstup na kolonu. Určení mrtvého objemu má význam zejména při přenosu metody z jednoho instrumentu na druhý. Každý instrument má jiný mrtvý objem (Dead System Volume; DSV) a to hraje významnou úlohu při úpravě gradientové tabulky - tyto mrtvé objemy se musí korigovat tak, aby gradient byl na obou instrumentech stejný. Určení DSV je jednoduché. Cesta A se naplní vodou, cesta B se naplní mobilní fází obsahující např. propylparaben a naprogramuje se gradient, kdy se do systému pumpuje pouze mobilní fáze A a po 5 minutách skokem mobilní fáze B. V 10 minutě opět skokem se systém vrátí na počáteční podmínky. Změna absorbance se projeví na chromatogramu a dostane se následující záznam:

Otázka je v jakém místě odečítat "rozdíl" mezi naprogramovanou a pozorovanou změnou, nejčastěji je to v 50 % výšky.

Literatura

[1] Wells M.J.M., Clark C.R.: Anal. Chem. 53, 1341 (1981).

[2] Taylor G.: Proc. Roy. Soc. A219, 186 (1953)).

[Top of Page]

Last modified: