Vliv velikosti nástřiku na účinnost kolony

Na účinnost kolony vliv velikost nástřiku zejména u mikrokolon. Experimentálně bylo zjištěno, že velikost nástřiku neovlivní účinnost kolony, jestliže vzorek zaujme v koloně prostor odpovídající Ön/2 to znamená, že pro kolonu s n = 1000  může zaujmou asi 16 pater a 1,6 % její délky, pro kolonu s n = 5000 asi 35 pater, ale jen 0,7 % její délky.

Exaktně vyjádřeno je maximálně použitelný objem dávkovaného vzorku V_I závislý na účinnosti chromatografického systému vyjádřený počtem teoretických pater n a na retenčním objemu V_R:

kde a je konstanta vyjadřující rozmytí píku. Nemá-li rozmytí dosáhnout 10 % je a = 1,1, pak vyjádřením mimokolonového příspěvku nástřiku vzorku k rozšíření zóny (vzhledem k aditivitě jednotlivých příspěvků k rozmytí eluční zóny dostaneme):

kde s_vI² je rozptyl objemového rozmytí způsobeného objemem dávkovaného vzorku.

Při použití mikrokolony s vnitřním průměrem 1 mm, délkou 150 mm a sorbentem s částicemi o velikosti 5 µm by dávkovaný objem neměl přesáhnout 0,84 µl, při použití kolony s vnitřním průměrem 0,5 mm a délkou 100 mm se tento objem snižuje na 0,17 µl a při zkrácení kolony na 20 mm je pak maximálně dávkovaný objem 0,08 µl. Tento objem je technicky nemožné dávkovat na mikrokolonu a vzniká tedy paradox mezi objemem dávkovaného vzorku a malým retenčním objemem. Na mikrokolonu se dávkuje vzorek o objemu V_I, který přesahuje daleko retenční objem V_R a v tomto případě můžeme na proces dávkování hledět jako na chromatografii se stupňovitým gradientem síly mobilní fáze - významnou roli zde totiž hraje retenční síla solventu vzorku, která je charakterizována kapacitním poměrem solutu v solventu vzorku k_S. V tomto případě musí platit, že kapacitní poměr k_S >> k, kde k je kapacitní poměr solutu v mobilní fázi a pak platí pro retenční objem: 

V_R = V_I + kV_M

ze kterého je zřejmé, že je na mikrokolonu možné dávkovat vzorek o objemu několikanásobně převyšující mrtvý objem kolony. V případě, že  k_S = k, pak velikost V_I  je omezena pouze rovnicí.

Pro velikost objemu nástřiku V_I vyhovuje velmi dobře vztah:

Máme-li kolonu o vnitřním průměru 4,6 mm a kapacitní poměr k = 5, účinnost kolony je n = 10 000, pak objem nástřiku V_I by měl zaujmout maximálně 289 pater tj. 2,9 % délky kolony. Pro kolonu o délce L = 250 mm to pak odpovídá asi nástřiku 120 µl, ale pro kolonu o délce L = 100 mm pouze 50 µl aniž by došlo k ovlivnění účinnosti separace.