Definice a problematika konfirmace je prodrobně rozebrána zde.

Nabídku na konfirmaci HPLC naleznete zde.

Ukázka konfirmačního protokolu pro konfirmaci HPLC (linearita teploty kolonového termostatu).

Pokud máte zájem o bližší informace, napište E-mail

Modulární_konfirmace

1. HPLC pumpa

2. Nástřikové zařízení - autosampler

3. UV Detektor

4. Termostat kolony

Konfirmace systému

1. Reprodukovatelnost průtoku mobilní fáze a objemového nástřiku

2. Linearita gradientu a průběh gradientu

3. Linearita UV detektoru

4. Linearita nástřiku

5. Šum a drift detektoru

6. Křížová kontaminace

Literatura

Modulární konfirmace

1. HPLC pumpa

1.1 Průtok

Konfirmuje se průtok HPLC pumpy pro průtok methanolu v ml/min. Kriterium: Relativní odchylka od nastaveného průtoku F_rel by neměla být větší než udává výrobce ve specifikaci přístroje (pokud není uvedeno pak F_rel £ 1 %.

1.2 Těsnost pístů – tlakový test

Konfirmuje se těsnost HPLC pumpy po jejím natlakování jako relativní pokles tlaku v čase D p. Kriterium: Průměr D p ze 3 měření nesmí být menší než 15 % relat.

2. Nástřikové zařízení - autosampler

Konfirmace autosampleru spočívá v kalibraci objemového nástřiku (µl), kalibraci linearity objemového nástřiku, detekce pozice vialky v karuselu a teplota pracovního prostoru.

2.1 Objem nástřiku

Objem nástřiku se konfirmuje na základě úbytku hmotnosti vody (při 20 °C) ve vialce při definovaném objemu nástřiku a vyjadřuje se jako relativní odchylka V_rel. Hmotnost vody se váží na vahách s přesností na 0,1 mg. Kriterium: Hodnota V_rel by neměla být větší než udává výrobce ve specifikaci přístroje (pokud není uvedeno pak V_rel £ 1 %).

2.2 Linearita nástřikového objemu

Linearita nástřiku se konfirmuje na základě úbytku hmotnosti vody (při 20 °C) ve vialce při definovaném objemu nástřiku pro různé objemové úrovně (např. 20 µl, 40 µl, 60 µl, 80 µl a 100 µl). Z naměřených dat se metodou nejmenších čtverců vypočte regresní rovnice, kde objem nástřiku je nezávisle proměnná a hmotnost nástřiku závisle proměnná, a koeficient korelace r. Hmotnost vody se váží na vahách s přesností na 0,1 mg. Kriterium: Hodnota V_rel by neměla být větší než udává výrobce ve specifikaci přístroje (pokud není uvedeno pak V_rel £ 1 %). Kriterium: Nástřikový objem je lineární v případě, že korelační koeficient r ³ 0,99.

2.3 Detekce pozice vialky v karuselu

Detekce pozice v karuselu spočívá v kontrole, zda autosampler správně nalezne předem určené pozice vialky v karuselu. Počet kontrol závisí na celkovém počtu míst karuselu a je roven druhé odmocnině z tohoto počtu tzn., že při celkovém počtu 120 míst se kontroluje 11 pozic (√120 = 10,95). Při kontrole se může začít od vialky číslo 1 a dále se postupuje na pozici vialky + 11 atd. nebo se postupuje sestupným způsobem tj. od poslední vialky (n - 11). Do určených pozic v karuselu se vloží vialky s novým septem (nebo se použije víčko s alobalem) a autosampler se naprogramuje tak, aby z těchto vialek (pozic) odebral nástřik o minimálním objemu s retenčním časem 0,1 min. Kontroluje se, zda je septum perforované. Kriterium: Všechna septa musí být perforovaná.

2.4 Teplota pracovního prostoru

Tato zkouška se provádí pouze u chlazených dávkovačů. Teplota se nastaví na 10 °C, dovnitř chlazeného prostoru se vloží čidlo digitálního teploměru a prostor se nechá vytemperovat. Po ustálení teploty se odečte teplota na digitálním teploměru T₁ a porovná se s teplotou řídící jednotky dávkovače T₀. Kriterium: Rozdíl teplot T₁ - T₀ nesmí být větší než 2 °C.

3. UV Detektor

U nejběžněji dostupných detektorů, UV detektoru a fluorimetrického detektoru, se kalibruje nastavení vlnové délky na standardní roztok zvolené látky a zjišťuje se lineární dynamický rozsah detektoru.

3.1 Nastavení vlnové délky

Nastavení vlnové délky se konfirmuje pomocí roztoků se známým a charakteristickým absorpčním spektrem. Sejme se spektrum (scan) látky a musíme dostat charakteristické spektrum.

Je možné použít:

Kriterium: Přípustná odchylka od těchto maxim je ± 2 nm.

3.2 Lineární dynamický rozsah

Mezi koncentrací složky v efluentu r _M a intenzitou analytického signálu R (odezvou detektoru) je nejčastěji lineární vztah a v ideálním případě platí pro koncentrační detektor: R = k₁.r _M, kde k₁ je konstanta úměrnosti, která zde vystupuje jako citlivost. Tento lineární vztah však neplatí pro všechny detektory. Lineární úsek závislosti log R proti hodnotám log r _M se nazývá lineární dynamický rozsah detektoru. Prakticky se postupuje tak, že připraví sada kalibračních roztoků definované látky o přesné koncentraci a sleduje se odezva detektoru v mV nebo absorbančních jednotkách na koncentraci. Metodou nejmenších čtverců se vypočte regresní rovnice, kde koncentrace je nezávisle proměnná a odezva detektoru závisle proměnná, a koeficient korelace r. Kriterium: Lineární dynamický rozsah detektoru je v oblasti, kdy se směrnice pohybuje v oblasti 0,98 až 1,02.

4. Termostat kolony

Teplota se nastaví na 10 °C, dovnitř kolonového prostoru se vloží čidlo digitálního teploměru a prostor se nechá vytemperovat. Po ustálení teploty se odečte teplota na digitálním teploměru T₁ a porovná se s teplotou řídící jednotky termostatu T₀. Měření se opakuje pro teplotu 20, 30 a 50 °C. Kriterium: Rozdíl teplot T₁ - T₀ nesmí být větší než 2 °C.

Validace systému

Po kalibraci jednotlivých modulů systému se konfirmuje celý systém, který zahrnuje všechny předchozí kroky.

1. Reprodukovatelnost průtoku mobilní fáze a objemového nástřiku

Reprodukovatelnost průtoku mobilní fáze se vypočte z reprodukovatelnosti retenčního času. Pokus se opakuje 8 krát a vypočte se relativní směrodatná odchylka (RSD) retenčního času a plochy píku. Kriterium: RSD retenčního času se musí pohybovat < 1 %, pro RSD plochy píku musí platit < 1 %.

2. Linearita gradientu a průběh gradientu

Linearita a průběh gradientu se sleduje při programové změně gradientu UV detektorem při 270 nm na základě průchodu 0,1 % roztoku acetonu systémem. Vyjadřuje se jako relativní odchylka gradientu G_REL a odchylka od linearity d %. Kriterium: Pro relativní odchylku gradientu platí G_REL< 2 %. Kriterium: Odchylka od linearity d % < 2 %.

3. Linearita UV detektoru

Sleduje se závislost plochy píku zvolené látky v závislosti na koncentraci. Z naměřených dat se metodou nejmenších čtverců vypočte regresní rovnice, kde koncentrace je nezávisle proměnná a plocha píku látky závisle proměnná, a koeficient korelace r. Kriterium: Předpoklad linearity detektoru je platný do koncentrace, kdy pro korelační koeficient platí r ³ 0,999.

4. Linearita nástřiku

Sleduje se závislost plochy píku zvolené látky v závislosti na objemu nástřiku (5, 10, 15, 20, 25 a 50 µl). Z naměřených dat se metodou nejmenších čtverců vypočte regresní rovnice, kde objem nástřiku je nezávisle proměnná a plocha píku látky závisle proměnná, a koeficient korelace r. Linearita objemového nástřiku se může provádět v případě, že linearita detektoru je vyhovující. Kriterium: Předpoklad linearity nástřikového objemu je platný v případě, že korelační koeficient r ³ 0,999.

5. Šum a drift detektoru

Detektorem se nechá protékat dobře odplyněná mobilní fáze o zvolené průtokové rychlosti. Nastaví se zvolená vlnová délka po ustálení se 60 minut zaznamenává základní linie. Vytiskne se záznam tak, aby bylo možné odečíst pravítkem maximální šum N_max v rozmezí 5 minut a drift D za 60 minut. Kriterium: šum N_max 2.10^-5, drift 1.10^-4.

6. Křížová kontaminace

Připraví se kalibrační roztok zvolené látky o koncentraci 100 mg/l získané postupným ředěním základního roztokem mobilní fází. Objem nástřiku je 50 µl, nástřik se provede 2krát. Bezprostředně poté se na kolonu za stejných podmínek nastříkne 50 µl mobilní fáze. Kriterium: V čase zvolené látky nesmí být nalezen pík této látky jehož výška je větší než trojnásobek šumu základní linie.

Literatura

1. Maldener G.: Chromatographia 28, 85 (1989).

2. Furmann W.B., Layloff T.P.: ve sborníku Workshop of Antibiotics and Drugs in Feeds, 10^th AOAC Annual International Meeting and Exposition, 1992 Cincinnati, Ohio.

3. Pump Preventive Maitenance, LC-GC International 10(3), 150 (1997).

4. Function Control of HPLC Instruments According to Quality standards, LC-GC International 7(10), 568 (1994).

5. Lam H.: Performance Verification of HPLC (link).

[Top of Page]

Last modified: