Citlivost jako směrnice kalibrační křivky, linearita, mez detekce (LOD – limit of detection) a mez stanovitelnosti (LOQ – limit of quantification) spolu úzce souvisí. Mez detekce odpovídá koncentraci, pro kterou je analytický signál statisticky významně odlišný od šumu. Mez stanovitelnosti odpovídá koncentraci, při které je přesnost stanovení taková, že dovoluje kvantitativní vyhodnocení. Podle uzance se v separačních metodách mez detekce vyjadřuje jako trojnásobek šumu základní linie a mez stanovitelnosti jako desetinásobek šumu základní linie. Mez citlivostí a oběma limity pak můžeme dovodit vztah:

kde h_n je šum na základní linii a m je směrnice kalibrační křivky (zde ale f (c)=h závislosti výšky píku na koncentraci). Předpokladem správného výpočtu je, aby šum a výška píku byly ve stejných jednotkách. Definice meze detekce je pak patrná z obrázku.

Rozborem rovnic se dojde k závěru, že zvýšení na zvýšení citlivosti má vliv použitá chromatografický systém (šum - detektor, chromatografická čerpadla) a chromatografický proces (výška píku - chromatografická kolona a chromatograqfické podmínky). Pokud chceme snížit LOQ a LOD musíme zvýčit poměr signálu výška píku/šum. Jinak řečeno, čím vyšší bude výška píku a čím nižší bude šum, tím dostaneme nižší hodnoty LOQ a LOD. Rozmytí eluční zóny lze ovlivnit řadou parametrů - pro koncentraci solutu v maximu chromatografického píku c_max lze dovodit rovnici:

Koncentrace solutu c_max v maximu eluční zóny se zvyšuje:

1. s objemem nástřiku vzorku V_i
2. zkracující se délkou kolony (L)
3. snížením vnitřního průměru d_c kolony
4. zvyšující se eluční silou mobilní fáze (k)
5. zmenšením velikosti částeček náplně d_p

Mez detekce a mez stanovitelnosti



Z výpočtu pro LOD a LOQ je zřejmé, že čím vyšší bude odstup signálu od šumu, tím se dostaneme na nižší hodnoty LOQ a LOD. Proto pro zajímavost uvádím závislost pro výšku píku h_p:



kde c₀ je koncentrace analytu a A_S je faktor symetrie.

Z rovnice vyplývá, že výška píku se bude zvyšovat se zvyšující se účinností kolony, objemem nástřiku a koncentrací a snižujícím se kapacitním poměrem analytu a objemovým průtokem mobilní fáze.

Další přístupy k výpočtu LOQ a LOD

Kromě již výše uvedených přístupů se ještě můžeme setkat s obdobným výpočtem, kde namísto šumu základní linie h_n se počítá se směrodatnou odchylkou koeficientu s_a lineární závislosti y = a + bx (blíže také viz linearita). Vztahy pak vypadají takto:



Z mých vlastních zkušeností je ale hodnota směrodatnou odchylkou koeficientu s_a lineární závislosti nižší než šum základní linie h_n a dostáváme zcela jiné hodnoty.

Další z možných přístupů je výpočet LOQ a LOD z kalibrační přímky - linearity, bližší informace jsou uvedeny na tomto místě.

Velmi důležité je si uvědomit, že vypočtená hodnota LOQ by měla být součástí hodnocení linearity metody a hodnota LOQ musí být součástí kalibrační přímky, jinak tato hodnota zcel postrádá smysl.

Literatura

---

1. S. Ebel, H. Kühnert, W. Mück: Limits of determination and calibration in HPLC, Journal Chromatographia 23, 934-938 (1987)
2. Analytical Methods Committee, Recommendations for the definition, estimation and use of the detection limit, The Analyst, 112 (1987) 199-204.
3. Analytical Methods Committee, Measurement of near zero concentration: recording and reporting results that fall close to or below the detection limit, The Analyst, 126 (2001) 256-259.
4. G. Bauer, W. Wegscheider and H.M. Ortner, Limits of detection in multivariate calibration, Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 340 (1991) 135-139.
5. J. Vial and A. Jardy, Experimental comparison of the different approaches to estimate LOD and LOQ of an HPLC Method, Analytical Chemistry, 71 (1999) 2672-2677.
6. M.E. Zorn, R.D. Gibbons and W.C. Sonzogni, Weighted least-squares approach to calculating limits of detection and quantification by modeling variability as a function of concentration, Analytical Chemistry, 69 (1997) 3069-3075.
7. ISO 3534-1, Statistics-Vocabulary and symbols-Part 1: Probability and general statistical terms, ISO, Geneve, 1993.
8. ISO 11843-1, Capability of Detection - Part 1: Terms and definitions, ISO, Geneve, 1997.
9. ISO 11843-2, Capability of Detection - Part 2: Methodology in the linear calibration case, ISO, Geneve, 2000.

 

[Top of Page]

 

Last modified: