V mnoha případech problémy, které vznikají v chromatografickém systému, jsou způsobeny špatnou přípravou a užitím mobilní fáze. Problémy, které souvisí s přípravou a užitím mobilní fáze mohou být tyto:

zavzdušněná hlava chromatografické pumpy (čerpadla)

přítomnost vzduchových bublinek v cele detektoru

nízká citlivost fluorimetrické detekce vlivem přítomného kyslíku v mobilní fázi

nízká přesnost a reprodukovatelnost nástřiku vzorku

zanesení in-line filtrů, frit nebo kapilár vlivem přítomných nečistot v mobilní fázi

které se projevují zejména

zvýšeným tlakovým spádem na koloně

zvýšeným šumem základní linie

kolísavými retenčními časy (retenční čas je nereprodukovatelný)

abnormálním profilem chromatografického píku

Při přípravě mobilní fáze se doporučují následující postupy:

Používat vždy čistá rozpouštědla, pokud možno co nejvyšší čistoty (HPLC grade). Toto platí i pro všechna aditiva (kyseliny, soli, báze) přidávaná do mobilní fáze.

Všechny připravené mobilní fáze filtrovat přes filtr 0,45 µm nebo menší (0,2 µm pro UPLC). Toto je zejména kritické při použití mobilních fází obsahující soli a pufry. Je vhodné se ujistit, zda použitý filtr je kompatibilní s danou mobilní fází. Pro filtraci vodných roztoků se používají celulosové membránové filtry, pro filtraci organických a vodně-organických roztoků se používají  teflonové membránové filtry (obecně fluoropolymery).

Voda používaná k přípravě mobilní fáze musí být čistoty ultračistá nebo HPLC grade (vodivost menší než 0,5 µS). Kvalita vody je kritická zejména při použití gradientové eluce – nečistoty obsažené ve vodě se zadržují na koloně při použití mobilní fáze o malé eluční síle a se zvyšující se eluční silou mobilní fáze při gradientové eluci dochází k jejich vytěsnění z kolony. Jako zcela nevhodné je použití pouze deionizované vody, která obsahuje organické nečistoty, které mohou pozměnit účinnost kolony, dochází k mikrobiologickému růstu na koloně. Při přípravě vody čistoty pro HPLC je možné používat deionizovanou vodu, která se následně destiluje s přídavkem manganistanu draselného. Takto připravená voda se uchovává v chladnu a temnu se stříbrným drátkem na dně lahve z borátokřemičitanového skla. Tento postup se osvědčil v naší laboratoři. Nevhodné je uchovávat vodu resp. mobilní fáze v plastických nádobách (polypropylenu, polyethylen) neboť dochází k uvolňování látek, použitých při výrobě plastu a dochází tak ke kontaminaci vody resp. mobilní fáze.

Při uchovávání vody nebo mobilní fáze ve skleněných nádobách je nutné mít na paměti, že

dochází k absorpci všech aditiv použitých při přípravě mobilní fáze na skleněný povrch a to různou rychlostí

dochází k mikrobiologickému růstu

dochází k uvolňování silikátů ze skla, které mají nepříznivý vliv na dané aplikace

Je vhodné si ověřit používané nádoby a zásobní lahve, zda nedochází při použití mobilní fáze k výše uvedeným jevům. Je vhodné používat k přípravě a uchovávání mobilní fáze stejné zásobní lahve. Před přípravou a uchováváním je vhodné vždy nádobu vypláchnou mobilní fází, není doporučeno používat k vymývání těchto nádob detergentů, které se adsorbují na povrch nádoby a mohou být vymývány mobilní fází a toto pak může vést k driftu na základní linii, zejména při gradientové eluci. V případě použití detergentů k vymytí zásobních lahví se poté vymývají vodou čistoty HPLC a následně methanolem a vysuší se k suchu. Umístění zásobníku mobilní fáze má být vždy výše, než vstup do chromatografické pumpy. K ověření správného umístění zásobníku mobilní fáze se otevře vypouštěcí ventil a mobilní fáze musí samovolně vytékat.

Odvzdušnění a odplyněné mobilní fáze je velmi důležitý krok při přípravě mobilní fáze, protože může odstranit většinu problémů vznikající při chromatografické analýze. Odvzdušnění mobilní fáze přináší řadu výhod:

reprodukovatelné retenční časy

stabilní průtok mobilní fáze

nízký šum základní linie a vysokou citlivost u mnoha typů chromatografických detektorů (ECD, FLD).

K odvzdušnění mobilní fáze se používají čtyři metody, které se mohou vzájemně kombinovat:

vakuová filtrace

odvzdušnění na ultrazvukové lázni

probublávání mobilní fáze heliem

ohřev mobilní fáze (u velmi těkavých rozpouštědel je však tento způsob nepoužitelný)

in-line vakuový degaser,

přičemž nejčastěji se v současné době používá in-line degaser, od ostatních způsobů se opouští z důvodu nízké účinnosti těchto postupů a jejich pracnosti.