Separace na reverzní fázi v extrémních oblastech pH
U běžných typů kolon na reverzní fázi se rozmezí pH pohybuje od 2 do 8. Při použití fosfátových pufrů pH 8 na normální i reverzní fázi, zejména v kombinaci za vyšší teploty však dochází k výraznému snížení životnosti kolony – dochází k rozpouštění nosiče - většinou silikagelu tak jak je ukázáno na obrázku níže. Pro vysoké teploty je před fosfátovými pufry preferován pufr TRIS - Tris(hydroxymethyl)-aminomethan a pracovní pH 7.
|
1. Při pH < 2,5 dochází k hydrolýze silikagelu což se projevuje snížením retenčního času a dochází ke snižování životnosti kolony. V tomto případě je lepší použití polymerních kolon nebo speciálních kolon určených k tomuto účelu (např. Xterra, ZORBAX Extend-C18).
2. Při pH > 7,0 se silikagel začíná již rozpouštět a dochází ke snížení účinnosti kolony (vlivem zvýšení mrtvého objemu kolony), dochází ke snížení retenčního času, zpětný tlak na koloně vzrůstá. V tomto případě je lepší použití polymerních kolon jak již bylo uvedeno výše. V případě, že není polymerní kolonu možné použít (např. z důvodu nižší
účinnosti) je možné použít tzv. presaturační kolonu k prodloužení životnosti analytické kolony. Presaturační kolona (Pre-Sat) se zařazuje mezi HPLC pumpu a nástřikové zařízení:
|
Poněvadž je mobilní fáze pak saturována silikagelem, který se uvolňuje z presaturační kolony, rozpouštění silikagelu
v analytické koloně je sníženo na minimum.
3. Nejlepší řešení separace v oblastech pH < 2 a pH > 8 je použití polymerních fází, které jsou většinou kompatibilní v celém rozsahu pH. Nevýhodou polymerních fází je, že částečky obsahují mikropóry o velikosti asi 1 nm, což zabraňuje přenosu hmoty zejména malých molekul. Polymerní stacionární fáze jsou dále omezeny maximálním pracovním tlakem na
koloně a to 20 MPa i když 10 MPa je pro většinu aplikací HPLC dostačující. Stabilita polymerních stacionárních fází je omezena stabilitou funkčních skupin polymeru – pro methylakrylát je limitující stabilita esterové skupiny, pro akrylamid je limitující stabilita amidové skupiny. I když současně připravované polymerní fáze jsou dostatečně mechanicky i chemicky stálé, pro jejich nižší účinnost dosud nevytlačily z použití chemicky vázané nepolární stacionární fáze. Styrendivinylbenzen byl použit jako stacionární fáze v iontově-výměnné chromatografii dávno před použitím v HPLC. Ve srovnání s chemicky vázanou fází C18 je retence na styrendivinylbenzenu vyšší a k dosažení rozumných retenčních časů je nutné zvýšit obsah organického rozpouštědla v mobilní fázi. Toto zvýšení retence je vysvětlováno specifickými interakcemi analytu s p-elektrony stacionární fáze, ale toto vysvětlení není příliš korektní, protože neplatí pro fenylovou fázi, která by měla vykazovat obdobné zvýšení retence. Lepší vysvětlení je zvýšení specifického povrchu nosiče a tím i fázového poměru a distribuční konstanty. Styrendivinylbenzenová fáze je stabilní v rozsahu pH 0 až 14, nejčastější použití je analýza proteinů a peptidů, kdy pro tyto druhy analytů nehraje významnou roli mikroporosita náplně a chromatografická účinnost je srovnatelná s chemicky vázanou fází C18.
4. Porézní grafitovaný uhlík je používán od roku 1988, kdy byl uveden na trh.[1],[2] Jeho velkou výhodou je stabilita v oblasti pH 1 - 14, stabilita tlaková je do 40 MPa. Při porovnání retence hydrofobních látek na uhlíkových sorbentech a sorbentech typu alkylsilikagelů, se uhlíkový sorbent vyznačuje o něco vyšší afinitou, u aromatických a polárních látek je tato afinita daleko vyšší. Toto je vysvětlováno přítomností delokalizovaných p-elektronů na povrchu uhlíkového sorbentu a dochází tak ke specifickým interakcím sorbent-solut.[3] Kromě toho jsou často pozorovány na uhlíkovém sorbentu chvostující píky, které indikují heterogenitu povrchu sorbentu. Přítomnost fixních adsorpčních center na povrchu sorbentu zajišťuje vyšší selektivitu sorbentu k dělení polohových isomerů.[4] Výhodou uhlíkových sorbentů je možnost změny retence bazických látek změnou pH mobilní fáze a to, že chování těchto látek na tomto sorbentu se dá daleko více předpovídat než na sorbentech typu alkylsilikagelů, které obsahují zbytkové silanolové skupiny a jsou omezeny rozpustností silikagelu v alkalických oblastech pH.
5. Rozpustnost silikagelu při vyšším pH mobilní fáze vedlo k vývoji alternativních HPLC kolon na bázi oxidů kovů (oxidu titaničitého, oxidu hlinitého), ale zejména (oxidu zirkoničitého).
Literatura
[1] Knox J.H. , Gilbert M.T.: UK Patent 7,939,449 (1979).
[2] US Patent 4,263,268 (1981).
[3] Hennion M.-C., Coquart V., Guenu S., Sella C.: J. Chromatogr. A712, 287 (1995).
[4] Knox J.H., Unger K.K., Mueller H.: J.Liquid Chromatogr. 6, 1 (1983).
Last modified: