Vliv aktivity zbytkových silanolových skupin
I nejlépe připravená chemicky vázaná stacionární fáze obsahuje zbytkové polární silanolové skupiny jejichž obsah se pohybuje kolem 4 mmol/m2 a typický obsah ligandových skupin se pohybuje někde kolem 3,5 £ mmol/m2, tím pádem obsahuje více „residuálních“ silanolových skupin než ligandů. Ačkoli většina těchto silanolových skupin není stéricky dostupná chromatografovaných látkám, jsou ještě dostatečně přístupné pro interakce s analytem a mobilní fází (vodíkové vazby, dipól-dipólové interakce, iontově-výměnné) a toto je potom příčinou stoupající retence a chvostování píků polárních, zejména bazických látek. Iontově-výměnné reakce zbytkových silanolových skupin jsou dominující pro interakce s bazickými látkami a jsou funkcí pH mobilní fáze. Se stoupajícím pH mobilní fáze roste vliv zbytkových silanolových skupin, protože roste jejich počet s negativním nábojem (pH 6-8). Proto se v praxi používá eliminace nepolární fáze tj. minimalizování interakce bazických látek s volnými silanolovými skupinami (a tím minimalizace tailování píků) a tím i nutnost zvyšování obsahu chemicky vázaného uhlíku v nepolární fázi (carbon load). Existuje několik způsobů eliminace, které budou popsány dále.
Endcapping je fyzikálně-chemický proces, který redukuje počet volných silanolových skupin na nepolární fázi (na bázi silica) chemickou reakcí např. s trialkylchlorsilanem (alkyl - methyl). Trimethylchlorsilan jako menší molekula než trioktadecylchlrosilan pokryje stéricky bráněné volné silanolové skupiny (
obrázek).
Grafické znázornění endcappingu
Stérické stínění volných OH skupin
Eliminace silanolových skupin stérickým odstíněním při přípravě chemicky vázaných fází, tj. přípravou fází s delším organickým uhlíkovým řetězcem a zvýšením obsahu vázaného uhlíku v nepolární fázi (carbon load), s tímto však současně roste i retence látek. Dokonalé stérické odstínění zbytkových -OH skupin lze docílit použitím objemných alkyl substituentů R1, R3 -diisobutyl nebo diisopropyl. Jako příklad lze uvést stacionární fázi Zorbax StableBond (Agilent, USA):
Výhodou těchto stacionárních fází je vysoká stabilita vůči nízkým pH mobilní fáze (~1) a mobilní fázím obsahující trifluoroctovou kyselinu, je stabilní při teplotě až 90 °C a při použití 100 % vodné mobilní fáze nedo-chází ke kolapsu této fáze.
Začleněním polární skupiny do organického uhlíkového řetězce stacionární fáze mezi povrch silikagelu a nepolární vrstvy (ligand) např. karbamátové skupiny - reverzní fáze SymmetryShield RP8 nebo Supelcosil ABZ+:
Tento krok zmírňuje interakci analytu s povrchovými volnými silanolovými skupinami, zejména bazických polárních látek. Pravděpodobně dochází k interakci mírně polární skupiny s volnými silanolovými skupinami a zvýšením polarity nepolární fáze dochází ke zvyšující se adsorpci vody v mobilní fázi.
Z popisu chování silanolových skupin k mobilní fázi je zřejmé, že tyto můžeme eliminovat i úpravou pH mobilní fáze a to přídavkem organických aminů do mobilní fáze. Ty soutěží s analytem o aktivní centra zbytkových silanolových skupin a eliminují tak jejich chování. Nejčastěji se používá triethylamin, pokud je triethylamin nedostačující, používá se trioctylamin nebo cetyltrimethylamonná sůl. Použití cetyltriethylaminu je velmi efektivní, ale prodlužuje se doba ekvilibrace kolony a retenční čas chromatografovaných látek. pH takto připravené mobilní fáze se musí upravit na hodnotu pH 2-7, jinak dochází k rozpouštění silikagelu. Jako přídavek se používá kyselina fosforečná, octová nebo citronová, u cetyltrimethylamonné soli se pH upravovat nemusí. Model je graficky zobrazen na obrázku.
Eliminace volných silanolových skupin přídavkem organického aminu do mobilní fáze
Z komerčně dostupných náplní s chemicky vázanými fázemi lze uvést nepolární fáze s alkylovými řetězci různé délky (C2-C18), s fenylovými a difenylovými skupinami, které mají zvýšenou polaritu a rozdílnou selektivitu zejména k fenolům a aminosloučeninám. Střední polaritou se vyznačují fáze nitrilové (alkylnitrily) a amidové, které se vykazují zvýšenou selektivitou k fenolům, cukrům a alkoholům. Aminové fáze mají slabé vlastnosti iontoměniče (anexu).
Hlavní a podstatnou nevýhodou chemicky modifikovaného silikagelu je jeho rozpustnost v alkalické oblasti pH a mnoho chromatografických systémů by rádo upřednostnilo alkalickou oblast pH zejména pro separaci bazických látek. Tomuto požadavku vyhovují polymerní stacionární fáze, které jsou většinou kompatibilní v celém rozsahu pH. Nevýhodou polymerních fází je, že částečky obsahují mikropóry o velikosti asi 1 nm, což zabraňuje přenosu hmoty zejména pro malé molekuly. Polymerní stacionární fáze jsou dále omezeny maximálním pracovním tlakem na koloně a to 20 MPa i když 10 MPa je pro většinu aplikací HPLC dostačující. Stabilita polymerních stacionárních fází je omezena stabilitou funkčních skupin polymeru – pro methylakrylát je limitující stabilita esterové skupiny, pro akrylamid je limitující stabilita amidové skupiny. I když současně připravované polymerní fáze jsou dostatečně mechanicky i chemicky stálé, pro jejich nižší účinnost dosud nevytlačily z použití chemicky vázané nepolární stacionární fáze.