UV/VIS HPLC detektory

Spektrofotometrické detektory jsou založeny na principu absorpce záření v oblasti vlnových délek od 190 do 800 nm. Kvantitativní vyhodnocení je založeno na Lambert-Beerově zákoně, který vyjadřuje vzájemný vztah mezi tloušťkou absorbující vrstvy (l), koncentrací absorbující složky (c) a vlastní velikostí absorpce, vyjádřenou jako absorbance (A):

eq_13.gif

kde e je molární absorpční koeficient (l/mol/cm). Platnost Lambert-Beerova zákona je nutným předpokladem pro jakékoliv spektrofotometrické měření a ověřuje se nejběžněji vynesením funkční závislosti A = fce(c) při l=konst., což je ve spektrofotometrických detektorech jednoznačně splněno. V případě, že kalibrační přímka prochází počátkem, nedochází k absorpci pozadí, v opačném případě pak kalibrační přímka protíná osu absorbance a je definována vztahem:

eq_14.gif

kde A0 je absorbance pozadí. Za přítomnosti dvou nebo více složek platí aditiva dílčích absorbancí a celková naměřená absorbance je dána vztahem:

eq_15.gif

Zákon Lambert-Beerův nezahrnuje vliv teploty, vlnové délky a rozpouštědla na hodnotu absorbance a proto je platnost Lambert-Beerova zákona omezena odchylkami – pravými a zdánlivými. Pravé odchylky se vyskytují tehdy, mění-li se v roztoku chemická rovnováha na základě měnící se koncentrace (iontová nebo molekulová interakce, disociace, asociace, dimerace či polymerace, tvorba komplexů a hydrolýza), zdánlivé odchylky jsou fyzikálního charakteru, především jako důsledek nedostačující monochromatičnosti záření.

Podle konstrukčního typu se mohou rozdělit detektory na čtyři typy:

  • Detektory s fixní vlnovou délkou (nejčastěji 253,7 nm), které používají jako zdroje záření nízkotlakou rtuťovou výbojku.
  • Detektory s měnitelnou vlnovou délkou, a to pouze předem danými vlnovými délkami.
  • Detektory s programovatelnou vlnovou délkou; vlnovou délku lze nastavovat v určitém rozmezí, nejčastěji od 190 do 700 nm. Vlnová délka je měnitelná během analýzy, některé typy detektorů dokáží snímat pak spektra látek (scan) v měrné cele při zastaveném průtoku mobilní fáze (stop flow). Některé firmy nabízejí detektory umožňující měření při dvou až čtyřech vlnových délkách současně, jejich nevýhodou je však poněkud nižší citli-vost ve srovnání s detektory s fixní vlnovou délkou.
  • Detektory diodového pole (photodiode-array, PDA, DAD) snímají celé spektrum v reálném čase bez přerušení chromatografické separace (schéma). Záření ze zdroje (1) po průchodu štěrbinou (2), čočkou (3), clonou (4) a měrnou celou detektoru (5) se spektrálně rozkládá holografickou mřížkou (6), takže na každou z fotodiod (7) dopadá zářivý tok o určité vlnové délce zeslabený absorpcí v cele detektoru. Každá fotodioda je spojena s kondenzátorem, který je předem nabitý na určitou hodnotu. Fotoelektrický proud, který vzniká po dopadu záření na diodu pak vybije kondenzátor, který je úměrný intenzitě dopadajícího záření. V další fázi se kondenzátory nabíjí a měří se proud, který je potřebný na dobití příslušných kondenzátorů. Velikost tohoto proudu se ukládá do paměti řídící jednotky. Tato sekvence vybíjení a nabíjení se velmi rychle opakuje (řádově milisekundy – 10 ms na rozsah 190 až 600 nm) a takto se zaznamenávají údaje o absorbanci při každé vlnové délce v každém okamžiku. Spektrální rozlišení je dáno počtem diod na poli, který se pohybuje od 512 do 1024 diod, pak pro spektrální rozsah od 190 do 800 nm je při počtu diod 512 spektrální rozlišení 1,2 nm. Tyto detektory umožňují ve spolupráci s řídící jednotkou (počítačem) detekci látky při jakékoliv zvolené vlnové délce,umožňují porovnávat snímaná spektra s knihovnou spekter, vypočítají čistotu píku (identifikace látky).

    • Schéma detektoru s diodovým polem