Derivatizace v HPLC

2.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny

2.1.4 Isokyanáty a isothiokyanáty

Činidla s isokyanátovou skupinou resp. isothiokyanátovou skupinou reagují s aminy, fenoly a alkoholy za vzniku derivátů močoviny (thiomočoviny) nebo karbamátů (thiokarbamátů).

2-(4´-isokyanátofenyl)-6-methylbenzothiazol

2-(4´-isokyanátofenyl)-6-methylbenzothiazol reaguje s primárními i sekundárními aminy nejlépe v chlorbenzenovém roztoku podle schématu. Deriváty fluoreskují při hodnotách l = 374 nm s excitačním zářením l = 350 nm.^[1]

9-Isothiokyanátoakridin

9-Isothiokyanátoakridin je derivatizačním činidlem isothiokyanátového typu, který reaguje s primárními i sekundárními aminy za tvorby vysoce fluoreskujících derivátů. V případě aminokyselin reakce probíhá obdobně jak bylo popsáno a dochází k cyklizaci. V případě aminů může cyklizace ^[2] probíhat podle schématu. Prakticky se reakce provádí v prostředí toluenu přes noc za laboratorní teploty. K maximálnímu výtěžku reakce se reakční směs nechá působit UV záření (fotochemický reaktor). Toto má však své nevýhody, protože požadovaný nadbytek činidla přechází na akridin, který vykazuje velké pozadí fluorescence. Deriváty v toluenu fluoreskují při hodnotách l = 500 nm až 525 nm s excitačním zářením l = 295 nm až 310 nm. Přídavkem kyseliny chlorovodíkové v ethanolu se zvýší výtěžek fluorescence, ale snižuje se stabilita derivátů.^[3] Vlivem fotooxidačních reakcí mohou vznikat i další vedlejší produkty.^[4]

Fluoresceinisothiokyanát

Procedura pro stanovení volných aminokyselin jako fluoreskujících thiohydantoinů byla již popsána.^[5] Reakce probíhá v prostředí acetonu za přítomnosti pyridinu a hydrogenuhličitanu sodného při pH 9,0. Reakce je při teplotě 25 °C ukončena po 4 hodinách. Reakce je ukončena přídavkem ledové kyseliny octové na pH 4,5 a sraženina je rozpuštěna přídavkem acetonu a následně přídavkem kyseliny chlorovodíkové je fluorescein-thiokarbamoylderivát na thiohydantoin.^[6],[7]