Dansylchlorid (Dns-Cl) je jedno z nejstarších a nejrozšířenějších derivatizačních činidel vůbec, který poskytuje deriváty s aminy i některými fenoly. Reakce s primárními, sekundárními aminy a aminokyselinami probíhá v mírně alkalickém prostředí, vodně-acetonovém prostředí za několikanásobného nadbytku činidla. Za vyššího pH reaguje i s fenoly, imidazoly a pomalu dokonce i s alkoholy. Rychlost dansylační reakce vzrůstá se vzrůstajícím pH prostředí, ale současně vzrůstá rychlost hydrolýzy derivátů. Optimální pH prostředí se pohybuje od pH 9,5 do 10.
Dansylchlorid reaguje jak s primárními tak sekundárními aminokyselinami podle výše uvedeného schématu (XVIII) za vzniku příslušných sulfonamidů s absorpčním maximem při 298 nm, dansylderiváty fluoreskují při hodnotě vlnové délky l = 470 do 530 nm s excitačním zářením od l = 340 do 380 nm. Derivatizace probíhá výhradně před kolonou. Největší nedostatek je velmi dlouhý reakční čas (2 až 60 minut) a vysoká reakční teplota (60 až 100 °C). Polyfunkční molekuly aminů a aminokyselin reagují za vzniku multiderivátů (bazické aminokyseliny, N,N´-bis-Dns-histamin, tri-Dns-sperimidin, O,N-bis-Dns-tyramin). Wiedermeier a spolupracovníci minimalizovali vznik multiderivátů při reakci za laboratorní teploty při pH 8,5.[1]
Výhodou je naopak jednoduchý derivatizační krok a celý může být proveden ve velmi krátkém čase a deriváty jsou stabilní až dva týdny při teplotě 4 °C.[2] Při reakci aminokyselin s Dns-Cl reaguje v prvém kroku aminoskupina, bohužel při velkém nadbytku činidla reakce směřuje ke vzniku směsných anhydridů, zejména při vyšším pH. Ty se poté rozpadají za vzniku oxidu uhelnatého, dansylaminu, aldehydu o jeden uhlík chudší než mateřská aminokyselina a dimethylaminonaftalen-1-sulfonové kyseliny (XIX).[3] g - aminokyseliny za těch samých reakčních podmínek poskytují g - laktamy.[4],[5]
Dansylderiváty jsou žluté krystalické látky, rozpustné v organických rozpouštědlech a pouze mírně rozpustné ve vodě. Rozpustnost ve vodě závisí na pH roztoku. Spektrální vlastnosti závisí na molekulární struktuře, ale také na vlastnostech rozpouštědla a pH. Dansylderiváty mají hodnoty absorpčního koeficientu - e252 = 1,3x104, e333 = 4,3x103 v methanolu.[6] Se snižující se dielektrickou konstantou rozpouštědla se zvyšuje fluorescenční výtěžek a dochází k hypsochromnímu posunu emisního maxima.[7]
Bansylchlorid (Bns-Cl) je analogem dansylchloridu.[8] Deriváty bansylchloridu jsou stabilnější, ale reakce s aminy je mírně pomalejší. Výtěžek fluorescence je u těchto derivátů ve srovnání s dansylchloridem asi o 10 % vyšší. Bansylderiváty jsou ve srovnání s dansylderiváty méně polární a jsou tudíž extrahovatelné lépe z reakční směsi organickými rozpouštědly o nižší polaritě (ethylacetát). Jeho použití je stejné jako dansylderivátu.[9]
Mansylchlorid (Mns-Cl) reaguje s primárními i sekundárními aminy obdobně jako dansylchlorid a byl navržen jako činidlo k určení N-terminálních aminokyselin.[10] Ve srovnání s dansylchloridem mají mansylderiváty vyšší absorpční koeficient - e231 = 4,2x104, e321 = 2,3x104 v propanolu.[11] Mansylderiváty fluoreskují při hodnotách l = 450 nm s excitačním zářením l = 321 až 324 nm.
Disylchlorid (Dis-Cl) reaguje s aminy, imidazoly, fenoly a alkoholy na příslušné amidy resp. estery.[12] Sulfonamidy jsou stabilní vůči 6M-HCl. Reakce probíhá v alkalickém prostředí hydrogenuhličitanu sodného (0,1 M-NaHCO3) s Dis-Cl (v acetonu). V případě, že dojde k vyloučení sulfonylchloridu přidá se aceton k rozpuštění sraženiny. Reakce probíhá 3 hodiny za laboratorní teploty.[13] Disylchlorid tvoří oranžové až červené deriváty. Tyto deriváty mohou být převedeny na vysoce fluoreskující deriváty - 1-fenyl-3-p-sulfofenylisobenzofurany - reakcí s alkoholickým KOH nebo ethoxydem sodným.[14] Toto zvýšení detekce umožní detekovat aminokyseliny v rozmezí 0,1 až 1 pmol.
1,2-naftoylbenzimidazol-6-sulfochlorid reaguje s alifatickými i aromatickými aminy, imidazoly.[15] Reakce probíhá v acetonitrilu za přídavku vodného roztoku uhličitanu draselného při teplotě 40 až 45 °C. Detekční limit je 0,1 pmol až 50 fmol.[16],[17]
[1] Wiedermeier V.T., Porterfield S.P, Hendrich C.E.: J. Chromatogr. 231, 410 (1982).
[2] G.J. Schmidt, Olson D.C, Slavin W.: J. Chromatogr. 164, 355 (1979).
[3] Neadle D.J., Pollit R.J.: Biochem. J. 97, 607 (1965).
[4] Seiler N., Wiechmann M.: Hoppe-Seyler´s Z. Physiol. Chem. 349, 588 (1968).
[5] Seiler N., Schneider H.H., Sonnenberg K.-D.: Fresenius´Z. Anal. Chem. 252, 127 (1970).
[6] Seiler N.: Methods Biochem. Anal. 18, 259 (1970).
[7] Chen R.F.: Arch. Biochem. Biophys. 120, 609 (1967).
[8] Seiler N., Schmidt-Glenewinkel T., Schneider H.H.: J. Chromatogr. 84, 95 (1973).
[9] Kamimura H., Sasaki H., Kawamura S.: J. Chromatogr. 225, 115 (1981).
[10] Cory R.P., Becker R.R., Rosenbluth R, Isenberg T.: J. Am. Chem. Soc. 90, 1643 (1968).
[11] Rosmus J., Deyl Z.: Chromatogr. Rev. 13, 163 (1971).
[12] Ivanov Ch.P.: Monatsh. Chem. 97, 1499 (1966).
[13] Ivanov Ch.P., Vladovská Y.: J. Chromatogr. 71, 111 (1972).
[14] Ivanov Ch.P., Vladovská Y.: Biochim. Biophys. Acta 194, 345 (1969).
[15] Tocksteinová D., Šlosar J., Urbánek J., Churáček J.: Mikrochim. Acta II, 193 (1979).
[16] Jandera P., Pechová H., Tocksteinová D., Churáček J., Královský J.: Chromatographia 16, 275 (1982).
[17] Tocksteinová D., Novák A., Horáková H., Nepraš M., Churáček J.: Collect. Czech. Chem. Commun. 48, 2249 (1983).
