Derivatizační techniky v HPLC
Použití derivatizace v HPLC
Derivatizace v HPLC se používá z několika ryze praktivkckých důvodů:
zvýšení citlivosti nebo umožnění detekce vůbec
zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec
zamezení nežádoucí sorpce látek na koloně.
Způsoby derivatizace
Podle místa derivatizace můžeme rozdělit derivatizační techniky na tři kategorie:
Předkolonová derivatizace (pre-column chromatography); chemická reakce probíhá před kolonou
Postkolonová derivatizace (post-column chromatography); chemická reakce probíhá za kolonou
Derivatizace na koloně; chemická reakce probíhá přímo v koloně
Všechny způsoby derivatizace mají vliv na eluční charakteristiky separovaných látek (účinnost separace a dobu analýzy), ale požadavky na deriváty a derivatizařní reakce jsou poněkud odlišné.
Požadavky na deriváty předkolonové derivatizace
- derivát musí být chemické individuum a měl by být dostatečně stabilní
- derivatizační reakce musí probíhat kvantitativně
- derivatizační reakce nemusí probíhat rychle
- reakce by měla být pokud možno selektivní
- reakce by měla být bez vedlejších produktů a měla by probíhat za mírných reakčních podmínek (pH, teplota) tak, aby nebyla nutná předseparace vzniklého individua
- při použití nadbytku derivatizačního činidla musí být dobře separovatelné od svých produktů na koloně a pokud možno by mělo mít jiné fyzikálně-chemické vlastnosti (nevykazuje fluorescenční vlastnosti)
Z předešlého výčtu je zřejmé, že předkolonová derivatizace vyžaduje poměrně velkou experimentální náročnost a zkušenost operátora (reprodukovatelnost výsledků).
Požadavky na deriváty postkolonové derivatizace
- derivatizační reakce nemusí poskytovat jednoznačné chemické individuum
- derivatizační reakce nemusí probíhat kvantitativně, ale rozhodující je dobrá reprodukovatelnost chemické reakce
- derivatizační reakce musí probíhat rychle, reakce může probíhat za extrémních podmínek (pH, teplota)
- používá se nadbytek reakčního činidla a dochází tak ke zřeďování mobilní fáze činidlem a dochází ke snížení účinnosti separace vlivem rozmytí chromatografické zóny
- reakce může být neselektivní, vedlejší produkty reakce nejsou na závadu
- není nutné hledat nové podmínky separace, neboť se vzorek separuje v nezměněné podobě
- vysoké náklady na techniku, neboť se musí používat speciální zařízení a reaktory, v nichž je nutno provádět řadu operací, výhodou je automatizace procesu derivatizace
- veškeré manuální operace jsou eliminovány
Reaktory používané za chromatografickou kolonou
Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu. Popis postkolonové derivatizace naleznete zde.
Derivatizační činidla a reakce pro jednotlivé organické skupiny naleznete zde na tomto místě.
Last modified: