Postkolonová derivatizace v HPLC (Post-column derivatization)

1. Požadavky na deriváty postkolonové derivatizace

2. Derivatizační techniky v průtokových reaktorech

3. Vlastní zkušenosti

4. Literatura

 

1. Požadavky na deriváty postkolonové derivatizace

  1. derivatizační reakce nemusí poskytovat jednoznačné chemické individuum
  2. derivatizační reakce nemusí probíhat kvantitativně, ale rozhodující je dobrá reprodukovatelnost chemické reakce
  3. derivatizační reakce musí probíhat rychle, reakce může probíhat za extrémních podmínek (pH, teplota)
  4. používá se nadbytek reakčního činidla a dochází tak ke zřeďování mobilní fáze činidlem a dochází ke snížení účinnosti separace vlivem rozmytí chromatografické zóny
  5. reakce může být neselektivní, vedlejší produkty reakce nejsou na závadu
  6. není nutné hledat nové podmínky separace, neboť se vzorek separuje v nezměněné podobě
  7. vysoké náklady na techniku, neboť se musí používat speciální zařízení a reaktory, v nichž je nutno provádět řadu operací, výhodou je automatizace procesu derivatizace
  8. veškeré manuální operace jsou eliminovány

 

1.1 Reaktory používané za chromatografickou kolonou

Derivatizace za kolonou se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu. V průběhu reakce dochází k rozmývání zóny v celém systému, které je nutno potlačit na minimum, čehož se dosáhne vhodnou konstrukcí reaktoru, směšovačů (více také naleznete zde...) a spojovacího potrubí. Konstrukce (objem a tvar) směšovacích kusů má vliv na rozmytí eluční zóny, promísení eluentu a činidla a na šum detektoru. Různé konstrukce a řešení směšovacích kusů jsou ukázány na obrázku č. 1. Obecně se volí taková konstrukce, aby docházelo při mísení ke vzniku turbulentního toku a rozmytí eluční zóny přitom bylo co nejmenší. K tomuto účelu je nejvhodnější konstrukce uvedená na obrázku č. 1 pod čísly III a IV. Další účinné mixéry jsou cyklónový mixer a rotační průtočný mixer.

Obr. č. 1 Různé konstrukce směšovacích kusů

Rozeznáváme v podstatě tři druhy postkolonové derivatizace:

1.1.1 Jednostupňová derivatizace

V tomto případě reakce probíhá v jednom reakčním kroku

1.1.2 Dvoustupňová derivatizace

Reakce probíhá ve dvou reakčních krocích - např. v prvním kroku dochází k oxidaci analytu a následně k jeho reakci s derivatizačním činidlem

1.1.3 Jednotupňová derivatizace s tvorbou derivatizačního činidla in situ

Činidlo se tvoří v reaktoru mísením dvou různých činidel (např. z důvodu nízké stability vznikajícího činidla)

Obr. č. 2 Derivatizační jednotka - dvoustupňová derivatizace (firma Science Instruments and Software, s.r.o. ČR)

Výrobci postkolonových derivatizačních jednotek (zařízení):

  • Pickering Laboratories
  • Science Instruments and Software
  • ASI
  • Analytical Instruments, LLC
  • SENSIVATE, ChromTech

    •  

    2. Derivatizační techniky v průtokových reaktorech

    2.1 Teorie toku mobilní fáze postkolonovým reaktorem

    2.2 Derivatizační techniky využívající tvorby derivátů reakcí s činidly v kapalné fázi

    2.3. Reakce vyvolaná změnou pH před vstupem do detektoru

    2.4 Derivatizační reakce v systému tuhá látka kapalina

    2.5 Fotochemické derivatizační reakce (působením UV záření)

    2.6 Elektrochemické derivatizační reakce

     

    2.1 Teorie toku mobilní fáze postkolonovým reaktorem

    V průběhu derivatizační reakce za kolonou dochází k rozmývání zóny v celém systému, které je nutno potlačit na minimum. Toho se dosáhne vhodnou konstrukcí reaktoru, směšovačů a spojovacího potrubí. Teorie toku mobilní fáze postkolonovým reaktorem.

    2.2 Derivatizační techniky využívající tvorby derivátů reakcí s činidly v kapalné fázi

    Tato technika je nejrozšířenější a je realizována v derivatizačním reaktoru, kdy do proudu mobilní fáze vycházející z kolony je aplikováno ve směšovací komůrce (zpravidla T-kusu, jejichž konstrukce je popsána řadou autorů [1],[2],[3] reakční médium, které vyvolá požadovanou reakci v samotném reaktoru, který může být termostatován.

    Na tento typ derivatizace jsou kladeny určité požadavky:

  • kapalný reagent musí být mísitelný s mobilní fází
  • nesmí docházet k reakci činidla a mobilní fáze
  • musí vznikat struktury poskytující charakteristické absorpce v UV-VIS oblasti nebo vykazují fluorescenci
  • využívají se i reakce redoxní, hydrolytické nebo vyvolávající změnu pH

    •  

    2.3 Reakce vyvolaná změnou pH před vstupem do detektoru

    Do této skupiny derivatizačních technik jsou zařazeny reakce, kdy nevznikají nové deriváty,avšak změnou pH dojde k výrazné změně absorpce v oblasti UV nebo fluorescence.[4]

     

    2.4 Derivatizační reakce v systému tuhá látka kapalina

    Vlastní reakce probíhá na povrchu tuhé fáze, která může vystupovat jako vlastní reagent, katalysátor nebo nosič vázané látky (zpravidla enzymu). Výhodou této techniky je, že nedochází ke zřeďování mobilní fáze činidlem a vliv na rozšíření chromatografické zóny je minimální. Pěkný příklad postkolonové derivatizace v systému tuhá látka-kapalina je stanovení nízkých hladin vitaminu K s fluorimetrickou detekcí. Vitamin K je redukován na hydronaphtochinon po předchozí hydrolýze. K redukci vitaminu K se používají tři způsoby redukce - postkolonová derivatizace s kovovým zinkem,[5] redukce elektrochemická nebo fotochemická redukce. Vitamin K1 může být redukován na příslušný hydrochinon (K1H2 kovovým zinkem za přítomnosti iontů zinku:

                      Zn ®  Zn2+ + 2e-

    2H+ + 2e- + K1 ® K1H2

    Zn + 2H+ +  K1 ® Zn2+ + K1H2

    Zinkový reduktor se zařazuje mezi analytickou kolonu a detektor (3,9x20 mm).

     

    2.5 Fotochemické derivatizační reakce (působením UV záření)

    Tato technika má velkou výhodu ve své vysoké specifičnosti a selektivitě, kdy se využívá především tvorby fluoreskujících sloučenin. Fotochemický reaktor se zařazuje mezi kolonu a detektor (obrázek č. 3). Jako příklad se často uvádí fotocyklodehydrogenace stilbenu za vzniku derivátů fenanthrenu (toto vede k vyšším hodnotám fluorescence i absorpce v UV oblasti spektra). Obecnou výhodou těchto reaktorů je, že nedochází ke zřeďování mobilní fáze činidlem.

    Fotochemické derivatizační reakce a jejich popis naleznete zde.

    Obr.č. 3 Schema postkolonové fotochemické derivatizace

    Výrobci postkolonových fotochemických derivatizačních jednotek:

  • Pickering Laboratories
  • Sigma Aldrich

    •  

    2.6 Elektrochemické derivatizační reakce

    Elektrochemická derivatizace se může aplikovat u všech analytů podléhající oxidaci nebo redukci. Účinnost elektrochemické derivatizace závisí na struktuře látky, vloženém napětí, složení mobilní fáze, geometrii (designu) elektrochemické cely a typu elektrochemické cely (amperometrický nebo coulometrický reaktor). Nejčastěji se zařazuje reaktor (cela) elekrochemické derivatizace mezi kolonu a detektor (obrázek č. 4, mezi dva detektory nebo před chromatografickou kolonu. Zařazení elektochemické derivatizace před chromatografickou kolonu má však svá omezení - reaktor je ve vysokotlaké části chromatografického systému a na konstrukci reaktoru jsou kladeny jiné požadavky než na elektrochemický reaktor zařazený za chromatografickou kolonu. Elektrochemický reaktor zařazený před kolonu mění selektivitu systému a může tak ovlivnit separaci analtů. Elektrochemická derivatizace může být rovněž kombinována s dalšími derivatizačními technikami. jako detektroy se používají nejčastěji detektory UV, fluorescenční nebo MS.

    Více informací týkající se elektrochemické derivatizace naleznete zde.

    Obr.č. 4 Schéma elektrochemické derivatizace

     

    3. Vlastní zkušenosti

    Z vlastních zkušeností s technikou derivatizační techniky využívající tvorby derivátů reakcí s činidly v kapalné fázi mohu doporučit optimalizaci těchto parametrů při optimalizaci metody:

  • průtok derivatizačního činidla a průtok mobilní fáze (viz obrázek)
  • teplota derivatizační reakce
  • vliv pH na derivatizační reakci.
  • koncentrace všech derivatizačních činidel

    • 4. Literatura

    Literární odkazy a podmínky vybraných derivatizačních reakcí za kolonou naleznete zde...

    [1] Scholten A.H.M., Brinkman U.A.T., Frei R.W.: J. Chromatogr. 205, 229 (1981).
    [2] Frei R.W., Michel L., Santi W.: J. Chromatogr. 142, 261 (1977).
    [3] Kučera P., Umgat H.: J. Chromatogr. 255, 563 (1983).
    [4] Douša M., Lemr K., Stránský Z.: J. AOAC Int. 88, 673 (2005).
    [5] Haroon Y., Bacon D.S., Sadowski J.A.: J. Chromatogr. 384, 383 (1987).
    [6] Engelhardt H., Neue U.D.: Chromatographia 15, 403 (1982).
    [7] Kobayashi S., Imai K.: Anal. Chem. 52, 1548 (1980).
     
    [Top of Page]
     

     

    Last modified: