Objevení metody iontové chromatografie se připisuje Dr. Gordonu Schillovi a spol. v roce 1973.[1]^,[2] Iontová párová chromatografie je separační metoda zlepšující (nebo umožňující) separaci sloučenin iontové povahy. Použitím iontového páru dochází většinou ke zlepšení tvaru píku (tailing faktor) a zvýšení rozlišení. Mechanismus separace pomocí iontového páru je popsán zde.

V minulosti se k chromatografické separaci používala metoda iontové suprese - pH mobilní fáze se upravuje na takovou hodnotu, aby analyt vystupoval v neionizované formě. Bohužel k dosažení této podmínky se musí pH mobilní fáze upravovat na poměrně extrémní hodnoty (pH<2 a pH>8) a navíc vzorek obsahuje jistě více než jednu ionizovatelnou sloučeninu. K separaci iontových sloučenin je možné použít poměrně oblíbenou ionexovou chromatografii, která však není použitelná obecně ve všech případech. Výhody iontové párové chromatografie oproti ionexové chromatografii jsou:

jednoduchá příprava mobilní fáze

široký výběr iontových párových činidel, jejichž koncentrací a typem činidla můžeme ovlivnit rozlišení a retenci

významné ovlivnění retence látek

současné separace iontových i neutrálních sloučenin

reprodukovatelnost výsledků

zvýšení účinnosti kolony

možnost použití gradientové eluce (delší doba ekvilibrace kolony !)

Jako iontová párová činidla se používají sodné soli alkylsulfonových kyselin (pentan-, hexan-, heptan-, oktan- a dodekansulfonáty) k separaci sloučenin kationtového typu a N-alkyl kvartérní amoniové soli (bromidy, sírany nebo chloridy) k separaci sloučenin aniontového typu. Na čistotu iontových párových činidel jsou kladeny vysoké požadavky (HPLC grade), typické absorbance těchto sloučenin jsou uvedeny v tabulce. Jak je z tabulky patrné, jsou hodnoty absorbance ve většině případech nižší než běžně používané solventy methanol a acetonitril čistoty HPLC grade.

Tab 1. Typická absorbance (AUFS) vodných roztoků iontových párových činidel o koncentraci 5 mM

Obecně retence iontové párové chromatografie závisí na:

koncentraci protiiontu ^[3] – s rostoucí koncentrací protiiontu retence separovaných látek s opačným nábojem roste, pro vyšší koncentrace protiiontu (asi nad 10 mmol/l) s rostoucí koncentrací protiiontu se retence separovaných látek s opačným nábojem vyrovnává a zvýšením koncentrace protiiontu se retence již nemění.

velikosti alkylu protiiontu i chromatografovaného iontu (s rostoucí velikostí retence roste). Při optimalizaci separace se vybírá takový protion, který zajišťuje přijatelné rozlišení vzhledem k době analýzy.

iontové sile a pH mobilní fáze - nastavení optimálního pH mobilní fáze podporuje disociaci chromatografovaných látek a tím i tvorbu iontových párů. Vliv pH mobilní fáze na retenčním poměru je ukázán na obrázku 2. pH mobilní fáze se nejčastěji upravuje na takovou hodnotu, aby bylo dosaženo maximálního rozlišení.

 

Obrázek 1. Závislost retence na délce alkylu

Chromatografické podmínky: (60/40) voda/methanol + 5 mM 1-alkyl-triethylamonniumfosfát, průtok: 0,6 ml/min

Vysvětlivky: £ - benzylalkohol, - kyselina benzoová

Obrázek 2. Závislost retenčního poměru benzoová kyselina/benzylalkohol na pH mobilní fáze

Chromatografické podmínky: (60/40) voda/methanol + 5 mM 1-alkyl-triethylamonniumfosfát, průtok: 0,6 ml/min

Vysvětlivky: £ - oktyl-,  - heptyl-, r - hexyl-

Jako další aditiva k přípravě mobilní fáze se používají: triethylamin, trihexylamin, triheptylamin a kyseliny octová, fosforečná a trifluorctová (TFA). TFA je obecně nejpoužívanější aditivum při přípravě mobilní fáze v iontové párové chromatografii, protože jde o těkavé činidlo a dá se tudíž dobře odstranit (spojení LC/MS), je dobře rozpustný i při vyšších koncentrací organických solventů v mobilní fázi a má velmi nízkou absorbanci - nevýhodou je jeho CutOff okolo 230 nm.

Praktický příklad použítí iontových párů na sepatraci 4-aminophenolu je ukázán na obrázku níže.

Separace 4-aminophenolu (c = 0,5 mg/ml). Chromatografické podmínky: Mravenčan amonný pH 3,8 – ACN (95+5). UV detekce 230 nm.

Separace 4-aminophenolu (c = 0,5 mg/ml). Chromatografické podmínky: 5 mM hexansulfonová kyselina/TEA/H3PO4 pH 2,5 – ACN (90+10). UV detekce 230 nm.

Literatura

[1] Eksborg, S.; Lagerstrom, P.; Modin, R.; Schill, G.; Ion Pair Chromatography of Organic Compounds; J. Chrom. 1973, 83, 99.

[2] Eksborg, S.; Schill, G.; Ion Pair Partition Chromatography of Organic Ammonium Compounds; Anal. Chem. 1973, 45, 2092

[3] Knox J.H., Hartwick R.A.: J. Chromatogr. 204, 3 (1981)

[Top of Page]

Last modified: 22. ledna 109