Regenerace analytické kolony - reverzní fáze C4, C8, C18; Phenyl
Při současných cenách analytických kolon je nejdůležitější otázkou životnost analytické kolony tj. jak skladovat kolonu a
jak kolonu popřípadě regenerovat k prodloužení její životnosti.
Uchovávání analytické kolony je popsáno zde. Částečně popsaný
problém regenerace kolony je také na těchto stránkách, podrobně tomuto problému se věnuji níže.
K prodloužení životnosti analytické kolony s reverzní fází je vhodné řídit se následujícími doporučeními.
V pravidelných intervalech analytickou kolonu proplachovat solventem (10-20 kolonového objemu) při polovičním průtoku mobilní
fáze než se používá obvykle. Jako solvent se volí nejčastěji methanol nebo acetonitril. Tímto procesem se jednak z kolony vytěsní látky a nečistoty, které za normálních podmínek neeluují vůbec nebo mají příliš velké kapacitní poměry vůbec a současně dochází k rekondicionaci stacionární fáze.
Obecná regenerace
K regeneraci kolony slouží různé "dekontaminační programy", které se volí vzhledem k předpokládaným kontaminantům. Jeden z nejjednodušších dekontaminačních programů je uveden níže:
|
Voda
|
30 ml
|
|
Methanol
|
30 ml
|
|
Tetrahydrofuran
|
30 ml
|
|
Dichlormethan
|
30 ml
|
|
Tetrahydrofuran
|
30 ml
|
|
Methanol
|
30 ml
|
Použití vody v prvním kroku je důležité vždy v případě použití pufrů jako mobilní fáze, při použití methanolu přímo může dojít k vysrážení pufrů v systému! Jako alternativu lze doporučit mobilní fázi methanol/voda (30+70 maximálně 50+50). Použití dichlormethanu slouží k eluci lipidů a malých hydrofóbních molekul, následné použití tetrahydrofuranu a methanolu slouží k převedení kolony opět do reverzního módu.
Kontaminace proteiny
Pro dekontaminaci proteinových kontaminantů je možno použít nástřik 100-200 µl dimethylsulfoxidu (DMSO) nebo 100-200 µl trifluorethanolu na kolonu do mobilní fáze se kterou jsou uvedené látky mísitelné. Tento postup se může opakovat dva- až třikrát. Další alternativní
postup: proplach kolony mobilní fází o složení 0,1M HNO3 (1+4)/isopropanol při průtoku kolem 20 % obvykle používaných průtoků přes noc. Další postupy naleznete na tomto odkazu.
Kontaminace lipidy
Pro dekontaminaci lipidů je možné použít následující postup: propláchnutí kolony mobilní fází voda + isopropanol (50+50), poté propláchnutí čistým isopropanolem a nakonec dichlormethanem a to asi 50 kolonovými objemy. Poté se kolona musí uvést opět do reverzního módu
propláchnutím mobilními fázemi v opačném pořadí.
Poslední krok
V případě, že předchozí procedury se neosvědčily může se vyzkoušet následující postup: připraví se roztok 6M guanidinu hydrochloridu ve vodě a tento roztok se filtruje přes sintr S4. Připraví se roztok smísením tohoto roztoku s isopropanolem (1+1) a na kolonu se nanese 250 µl tohoto roztoku při použití mobilní fáze isopropanol/voda (1+1).
Vzhledem k vlastnostem stacionární fáze dochází k „zadržování“ kontaminantů na počátku kolony. Posledním krokem proto může být otočení kolony proti obvyklému směru toku mobilní fáze a použití některých z dekontaminačních programů. Po ukončení regenerace kolony se kolona ponechá již v tomto módu (otočená).
K prodloužení životnosti analytické kolony je nejlepší způsob předcházet znečištění kolony kontaminanty a proto je vhodné vždy používat rozpouštědla čistoty HPLC a věnovat zvýšenou pozornost přípravě mobilní fáze i vzorku (zařadit purifikační kroky do přípravy roztoku vzorku) !
Last modified: